Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биофармацевтический анализ процессов метаболизма лекарственных средств. Монография
.pdf
21
CYP4503А4, CYP450 2Д6, 2Е1 и др., ответственные за биотрансфор-
мацию различных лекарственных веществ (ЛВ) и экотоксикантов.
Особая роль в метаболизме ксенобиотиков отводится фермен-
тативным системам конъюгации. Присоединение метильной группы
к субстрату – обычная реакция обмена, широко встречающаяся как в
анаболических, так и в катаболических процессах. Метилирование
может сопровождаться усилением биологической активности и ее
ослаблением. Донором метильной группы является активированный
метионин, превращающийся при этом в гомоцистеин. В зависимости
от того, какая функциональная группа в субстрате подвергается метилированию, различают N-, O- и S-метилирование. Так, фенилэтаноламины метилируются при участии N-метилтрансферазы, локализованной в мозговом слое надпочечников.
Значительно менее специфична метилтрансфераза, осуществляющая метилирование первичных, вторичных и третичных аминов.
Наибольшая концентрация N-метилтрансферазы сосредоточена в супернатанте клеток легких, печени, мозга. Из первичных аминов следует назвать триптамин и серотонин. Весьма многочисленна группа вторичных аминов, метилирующихся этим ферментом (норморфин, норкодеин, норникотин, N-метилсеротонин и др.). Ряд третичных аминов
(пиридин, хинолин) под влиянием метилтрансферазы превращаются в
четвертичные. Метилирование по атому кислорода катализируется
другой группой ферментов – о-метилтрансферазами.
Конъюгация – это процесс соединения токсичных веществ или
их метаболитов с группировками эндогенных молекул. Продуктами
данных реакций являются конъюгаты.
Конъюгаты немногочисленны и по химической структуре имеют много общего. Как правило, конъюгаты по своим физикохимическими свойствам значительно отличаются от исходных веществ. Они быстро экскретируются, их фармакологическая активность
либо отсутствует, либо резко ослаблена.
Конъюгация ксенобиотика или его метаболита с уксусной кислотой характерна для биотрансформации многих лекарственных и эндогенных веществ, в структуре которых имеется аминогруппа
(N-ацетилирование). Механизм ацетилирования, представляющего собой реакцию в несколько стадий, в настоящее время изучен до деталей. Конечная стадия катализируется ферментами – ариламинацетилтрансферазами. Эти ферменты высокоспецифичны по коферменту и менее специфичны по субстрату.
22
Все ариламины в организме весьма активно конъюгируют с ацетатом. Реакцию ацетилирования ариламинов нельзя в полном смысле
считать реакцией детоксикации, так как ацетилированные продукты,
например сульфаниламиды, в силу плохой растворимости кристаллизуются в мочевыводящих путях и могут влиять на их функции. К числу соединений, метаболизм которых протекает по пути ацетилирования, относятся, в первую очередь, лекарственные препараты – первичные ариламины (сульфаниламиды, новокаин, новокаинамид, производные п-аминофенола и п-аминобензойной кислоты), а также гидразид изоникотиновой кислоты, клоназепам (после восстановления
нитрогруппы), мескалин и эндогенные соединения – холин, серотонин, гистамин и т. д. Из числа ксенобиотиков, подвергающихся ацетилированию, следует отметить ароматические и алифатические амины,
гидразины. В частности, в тканях млекопитающих ацетилируются
изониазид, гидразин, бензидин, 4-аминоантипирин, анилин, сульфадимезин, сульфамеризин, фурфуриламин, серотонин, триптамин, гистамин, α-нафтиламин, метиленбис-o-хлоранилин.
Известно, что ксенобиотики ацетилируются в организме в неодинаковой степени. Так, общее содержание ацетилпроизводного
сульфадимезина в крови и моче может достигать до 93 % от введенной
дозы, а эффективность ацетилирования этазола и норсульфазола составляет соответственно 17 и 40 %. Следует отметить, что последние
два соединения близки в структурном отношении. Ацетилирование
ксенобиотиков, содержащих первичную ароматическую аминогруппу,
осуществляется, как известно, ариламиноацетилтрансферазой (ААТ) с
участием ацетил-КоА. В то же время экспериментально доказано, что
этот же фермент катализирует ацетилирование изониазида (по гидразидному фрагменту) и серотонина (по первичной алифатической
аминогруппе).
Метаболизм чужеродных веществ происходит в различных органах и тканях (легких, плаценте, коже, слизистой кишечника), но
большая часть превращений осуществляется в печени с участием ферментов, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов [37–40].
Различная скорость биотрансформации ЛС у разных людей является причиной различий в фармакокинетике. Такие различия в свою
очередь влияют на фармакологический ответ на введение этого ЛС
[42–49]. Скорость биотрансформации ЛС зависит от генетически детерминированной активности ферментов. Кроме генетических осо-
23
бенностей, на активность ферментов могут существенно влиять внешние факторы: табачный дым, пища, алкоголь, пол, возраст, сопутствующие заболевания, и др [46–58].
Для изучения скорости биотрансформации ЛС используется два
способа: фенотипирование и генотипирование. Определение фенотипа
является прямым методом определения активности того или иного
фермента биотрансформации по фармакокинетическим параметрам
тест-препарата и (или) его метаболита. Генотипирование – косвенный
метод. Он основан на изучении гена фермента методом полимеразной
цепной реакции (ПЦР) [41, 59–63]. Различные скорости метаболизма
ЛС, которые оцениваются по отношению концентрации этого ЛС к
концентрации его метаболита или самого непревращенного ЛС или
его производного в плазме крови, моче,слюне (метаболическое отношение), позволяют выделить группы пациентов, различающиеся по
активности фермента (рис. 1.5) [33, 41, 64–68].
Рис. 1.5. Распределение индивидуумов по скорости метаболизма,
оцененной по отношению концентрации ЛС в плазме крови
к концентрации его метаболита. БМ, ЭМ, ММ – быстрые,
экстенсивные и медленные метаболизаторы соответственно [41]
24
Быстрые метаболизаторы – это люди с высокой скоростью метаболизма определенных ЛС, являющиеся гомозиготными (при аутосомно-рецессивном типе наследования) или гетерозиготными (при
аутосомно-доминантном типе наследования) носителями «быстрого»
аллеля гена соответствующего фермента. В этой группе лиц наблюдаются пониженные показатели отношения концентрации ЛС к концентрации его метаболита. Это происходит вследствие интенсивного метаболизма ЛС. Таким людям необходима большая доза ЛС [33, 41].
Экстенсивные метаболизаторы – наиболее часто встречающаяся
группа лиц. Им характерна «нормальная» скорость метаболизма определенных ЛС. Являются носителями гомозиготного аллеля гена соответствующего фермента [33, 41].
Медленные метаболизаторы характеризуются низкой скоростью
метаболизма определенных ЛС. Такие лица гомозиготные (при аутосомно-рецессивном типе наследования) или гетерозиготные (при
аутосомно-доминантном типе наследования) носителя аллеля гена соответствующего фермента. У медленных метаболизаторов наблюдается высокое значение отношения концентрации ЛС к концентрации его
метаболита. Им свойственно накопление препарата и возникновение
интоксикаций, что необходимо учитывать при выборе доз ЛС [33, 41].
Носители соответствующих генов, характеризующиеся генетическим
полиморфизмом, распределяются в зависимости от скорости метаболизма по бимодальному или тримодальному типам распределения [33,
39, 69–74].
25
Глава 2. МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ОКИСЛЕНИЯ
И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
МИКРОСОМАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ
Важнейшими процессами, протекающими в первой фазе биотрансформации, являются реакции с участием цитохромов Р450 – монооксигеназной системы (МОС) ферментов, локализованной в эндоплазматическом ретикулуме клеток. Она осуществляет широкий круг
биохимических реакций, направленных на поддержание химического
гомеостаза организма [75].
Одними из наиболее важных функций системы МОС в организме являются биодеградация и детоксикация различных ксенобиотиков
(канцерогенных, токсических), лекарственных веществ, а также эндогенных соединений (стероидных гормонов, желчных кислот) [33, 34,
76–78].
Большое количество лекарственных веществ, подвергающихся
метаболизму под действием окислительных ферментов, и высокая вариабельность активности этих ферментов делают проблему изучения
микросомального окисления актуальной с практической точки зрения.
Чаще всего продукты микросомального окисления неактивны, и скорость окислительных реакций является определяющей для длительности воздействия лекарственного вещества, содержания его в крови на
терапевтическом уровне, т. е. для эффективности и безопасности применения лекарственных препаратов (ЛП) [33, 75].
Суть окислительных процессов ЛВ, катализируемых ферментами системы цитохромов Р450, сводится к гидроксилированию, т. е.
к введению гидроксильной группы в структуру фармакологического
препарата, что делает его более полярным и облегчает выведение почками. Гидроксильная группа может быть введена в результате реакций
окисления, восстановления или гидролиза, но наибольшее распространение имеет окислительное гидроксилирование, которое осуществляется дыхательной цепью, составленной из ферментов свободного окисления [34].
Система микросомального окисления состоит из двух компонентов: цитохрома Р450 и флавопротеида. Функция последнего заключается в восстановлении цитохрома Р450 посредством НАДФ и
называется НАДФН-цитохром-Р450-редуктазой [34, 75, 79]. Цитохром
Р450 представляет собой гемопротеин, или фосфолипид протогемсульфидпротеиновый комплекс, обладающий свойством взаимодей-
26
ствовать с субстратом окисления, активировать кислород и внедрять
его в субстрат. Он обнаружен как у растений, так и у животных. Химическая структура цитохрома Р450 содержит белковую часть и железопротопорфирин-IX. Строение протеиновой части может варьироваться, что обусловливает существование множества изоферментных
форм цитохрома (4 семейства), что, в свою очередь, обусловливает
широкую субстратную специфичность его в отношении различных
химических веществ, включая лекарственные препараты (табл. 2.1)
[32, 34, 80].
Таблица 2.1
Цитохромы Р450 и их субстратная специфичность [75]
Наименование
формы
цитохрома
Субстраты, подвергающиеся метаболизму
CYP1A1
Полициклические ароматические углеводороды,
бензо[α]пирен
CYP1A2
Кофеин, 2-нафтиламин, фенацетин, теофиллин,
ариламин
CYP2C9/10
Гексобарбитал, толбутамид
CYP2C18
Диазепам, гексобарбитал, омперазол, пропрано-
лол
CYP2D6
Кодеин, дебризохин, галоперидол, метопролол,
тримолол и др.
CYP2E1
Парацетамол, ацетон, анилин, бензол, этанол и др.
спирты, дихлорэтан, стирол, винилхлорид, винилбромид, нитрозамины и др.
CYP3A
Диазепам, эритромицин, лидокаин, этинилэстра-
диол, тестостерон и др.
Каталитическая активность цитохромов Р450 обусловлена наличием фосфолипидов, которые стабилизируют фермент в функционально активной конформации [49]. Наличие в цитохроме двухвалентного железа обеспечивает его способность связывать двухатомные газы, при этом окись углерода и оксид азота ингибируют цитохром, а кислород обладает сродством к Р450 [34, 80].
27
Ферменты монооксигеназной системы активируют молекулярный кислород и включают атом кислорода в молекулу субстрата. Монооксигеназная реакция происходит по следующей схеме [38, 75, 77]:
RH + O2 + ДH → ROH + H2O + Д,
где Д – донор электронов, RH – лекарственный препарат,
или
XH + O2 + 2e + 2H+ → XOH + H2O.
При этом один атом кислорода включается в молекулу субстрата, другой восстанавливается до воды. Таким образом, фермент выполняет не
только оксигеназную, но и оксидазную функцию [34, 75, 77].
Монооксигеназная система эндоплазматического ретикулума
гепатоцитов образует НАДФ∙Н- и НАДН-зависимую редокс-цепь [38].
Каталитический цикл цитохрома Р450 представлен на рис. 2.1. На
первой стадии окисленная форма фермента соединяется с субстратом,
образуя фермент-субстратный комплекс (RH)Fe
3+,
что подтверждается
спектральными изменениями в молекуле. На второй стадии происходит восстановление комплекса электроном, который передается
NADPH-редуктазой, вследствие чего образуется восстановленный
комплекс (RH)Fe2+.
Рис. 2.1. Каталитический цикл цитохрома Р450 [80]
28
На третьей стадии к этому комплексу присоединяется кислород
с образованием комплекса (RH)Fe2+О2, а в четвертой стадии после перенесения электронов из железа на кислород превращается в комплекс
(RH)Fe3+О2 (возможно образование супероксидного радикала вследствие его диссоциации). На пятой стадии (RH)Fe3+О2 восстанавливается электроном от NADPH – редуктазы или цитохрома b5 с образованием пероксикомплекса (RH)Fe3+О
2
=
. Далее на шестой стадии с уча-
стием двух протонов происходит гетеролитический разрыв связи О–О
с образованием воды и комплекса RH (Fe-О)3+, в котором находится
электрондефицитный атом кислорода. Последний комплекс считается
важнейшим окислителем в цикле цитохрома Р450. Одним из распространенных путей его взаимодействия с молекулой субстрата является
высвобождение атома водорода с образованием радикала субстрата и
координированного с железом гидроксильного радикала R - (Fe-ОH)3+
(стадия 7), с последующей его рекомбинацией. Затем гидроксильная
группа включается в молекулу субстрата ROH(Fe3+), после чего окисленный субстрат отделяется от фермента (стадия 8). Оксеноидный
комплекс RH (Fe-О)3+ является не единственным окислителем в каталитическом цикле цитохрома Р450. Такие же свойства проявляются и
у гипервалентных комплексов железа: нуклеофильного пероксижелеза, нуклеофильное или электрофильного гидроксипероксижелеза, любые их которых специфично взаимодействуют с субстратом. Разные
типы окислителей обеспечивают разнообразие механизмов окисления
субстратов, широкую субстратную специфичность монооксигеназ и
большое количество продуктов реакции (рис. 2.2) [80]:
Рис. 2.2. Окислители в каталитическом цикле цитохрома [80]
29
Необходимо отметить, что активность системы МОС генетически детерминирована. Видовая и индивидуальная вариабельность монооксигеназной системы является ее характерной особенностью.
С использованием близнецового метода было установлено, что индивидуальная вариабельность метаболического окисления ряда лекарственных препаратов на 70–100 % определяется наследственными
факторами [33, 74].
Больные, принимающие ЛВ, подвергающиеся биотрансформации посредством ферментов системы цитохромов Р450, по-разному
реагируют на введение данных ЛС. Одни переносят препараты легко,
у других появляются побочные эффекты. Оказалось, что различная
степень реагирования больных на те или иные ЛП зависит от скорости
их метаболизма, что обусловлено различной каталитической активностью окислительных ферментов В связи с этим индивидуумы были
фенотипированы как «быстрые», «средние» и «медленные» окислители [33, 34, 41, 81].
Полиморфизм цитохрома Р450 может быть причиной следующих процессов:
– чрезмерный терапевтический эффект вследствие замедленной
метаболической инактивации ЛС у лиц со сниженной активностью
ферментов («меденных метаболизаторов»);
– уменьшение лечебного эффекта вследствие ускоренной инактивации у лиц с аномально высокой активностью ферментов («быстрых метаболизаторов»);
– увеличение токсичности ЛС быстрыми метаболизаторами
вследствие быстрого образования токсичных метаболитов;
– повышение токсичности ЛС у медленных метаболизаторов,
вследствие того что ЛС само по себе токсично;
Замедленный метаболизм наблюдается при наличии мутантных
аллелей гена с «утраченной функцией», что кодирует белок со сниженной ферментативной активностью, а сверхбыстрый метаболизм
может обусловливаться дублированием гена. Промежуточные метаболизаторы гетерозиготны или несут аллели с мутациями, которые умеренно уменьшают активность ферментов [41].
Регуляция экспрессии цитохрома Р450 очень сложная. Она
включает как трансляционные механизмы (активации трансляции и
стабилизация его молекулы), так и транскрипционные (стимуляция
транскрипции и стабилизация мРНК). Данные литературы оноситель-
30
но особенностей влияния ксенобиотиков на экспрессию цитохрома
Р450 являются неоднозначными.
Выявление полиморфизма окисления является важным при проведении биофармацевтических исследований, поскольку оно может
объяснить причины возникновения побочных эффектов в результате
передозировки или отсутствия терапевтического эффекта. Методы
оценки фенотипа окисления постоянно совершенствуются в результате внедрения новых лекарств, их клинических испытаний в той или
иной популяции с учетом фенотипических особенностей [32, 82–85].
В настоящее время методы оценки активности ферментов системы микросомального окисления делят на две группы: прямые и
косвенные. Прямые методы разработаны для исследования тканей печени in vitro, поскольку именно этот орган с высоким содержанием
наиболее активных ферментов МОС приспособлен для осуществления
детоксикации [66]. Прямые методы требуют проведения травматичной
пункционной биопсии печени тонкой иглой [30]. Так, например, определяют активность некоторых изоформ цитохрома Р450 in vitro в печени человека, используя варфарин как тест-препарат. Варфарин и его
4 метаболита (6-, 7-, 8- и 10-гидроксиварфарин) определяют в образцах печени методами ВЭЖХ с хромато-масс-спектрометрическим детектированием, а активность ферментов при этом определяют по количеству образующихся метаболитов [86–89].
Наиболее подходящими клетками для практической реализации
прямых методов являются волосяные фолликулы, кожа, альвеолярные
макрофаги легких, плацента и клетки крови [61]. Однако использование крови как биологического материала ограничено, поскольку для
оценки активности ферментов МОС требуется большое количество
биожидкости, метод инвазивен, а также необходима активация лимфоцитов митогеном для усиления ферментативной активности [61].
Учитывая вышеприведенные ограничения, были разработаны
прямые методы для работы с материалом, полученным неинвазивным
путем. Для этих целей используют такие биоматериалы, как моча,
слюна, смывы с поверхности кожи и т. д. [76, 90]. Было проведено исследование волосяных фолликулов и эпидермиса, в которых обнаруживается наличие цитохрома Р450. Вследствие невысокого уровня цитохромов Р450 в этих тканях даже использование высокочувствительных хроматографических и радиоиммунологических методов с трудом
позволяет определить активность ферментов в клетках кожи [61, 91].
Достаточно точное определение цитохрома Р450 в тканях человека
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]