Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Биофармацевтический анализ процессов метаболизма лекарственных средств. Монография

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

06.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 8 910 / 1510 11 12 13 14 15 > Следующая >>>

Глава 7. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ЧЕЛОВЕКА

Биологические жидкости (моча, кровь, сыворотка, плазма, слюна) являются важными объектами анализа для клинической диагностики, исследования токсикокинетики, фармакокинетики, а также для оценки активности метаболических систем организма человека. Они имеют очень сложный, многокомпонентный состав, включающий большое число неорганических и органических соединений различной химической природы: микроэлементы, аминокислоты, полипептиды, белки, ферменты и др. Их концентрация колеблется от 10 мг/мл до несколько нанограммов. Даже в такой относительно простой физиологической жидкости, как моча, идентифицировано несколько сотен органических соединений.

Физический и химический составы биологических образцов зависят от индивидуальных особеностей организма (вес тела, эмоциональное состояние, скорость метаболизма), воздействия факторов внешней среды (состав пищи, физическая и психическая нагрузка и т. д.). В качестве объектов исследований в фармацевтической химии используются различные биологические материалы: кровь (сыворотка, плазма), моча, слюна, амниотическая, синовиальная жидкости, лимфа и др. Выбор объекта исследования зависит от многих факторов. В первую очередь, он определяется доступностью исследуемого материала. Как правило наиболее удобными объектами исследования являются кровь, моча и слюна. Свойства и состав мочи, крови, плазмы и сыворотки у нормальных взрослых людей представлены в табл. 7.1.

Большинство фармакокинетических исследований связано с определением концентраций препарата в плазме крови. Забор крови всегда связан с определенным риском и травмирующими моментами для детей и пожилых людей. Кроме того, из-за страха повторных заборов крови у больных может возникнуть замедление скорости всасывания препаратов из желудочно-кишечного тракта, что может привести к изменению ряда фармакокинетических параметров.

Таблица 7.1

Свойства и состав мочи, слюны, цельной крови, плазмы и

сыворотки у нормальных взрослых людей [336–338]

Cвойства

Моча

(г/1200 мл)

Слюна

Кровь

(мг/100 мл)

Плазма и

сыворотка

(мг/100 мл)

2 3 4

4,8–7,4

5,6–7,9

7,3–7,4

Вода

95 %

98 %

75–85 %

90–91 %

Вязкость

0,010–0,013

–

3,5–5,4

1,9–2,3 и

1,6–2,2

Cухой остаток

55–70

3–8 г/л

18–25 %

8,5–10 %

Соединения азота

Мочевина

20–35

140–

750 ммоль/л

15–40

10–40

Мочевая кисло-

та

0,1–2,0

0,005–0,030

г/л

0,3–4

2,6–7,0

Протеин

0,6–1,2

0,15–

0,64 г/100 мл

6000–8000

Аммиак

 0,8

– – –

Креатин

–

2,9–4,0

0,7–1,3

Креатинин

1–1,5

–

1,2–1,5

0,7–1,29

Свободные

аминокислоты

0,5

0,1–40

–

36–65

Глутатион

–

28–52

Другие органические соединения

Гиппуровая

кислота

 0,7

– – –

Общий сахар

0,5–1,5

– – –

Ацетоновые

тела

0,02–0,05

–

1,0–3,0

3,0–8,0

Липиды

–

0,2–2,0

0,45–1,20

Свободные

жирные

кислоты

0,05–0,8

–

0,29–0,42

0,19–0,64

Окончание табл. 7.1

2 3 4

Цитраты

0,15–0,30

–

1,3–2,5

1,6–3,2

Пигменты

0,01–0,13

– – –

Полисахарид

– – –

73–140

Глюкозамин

– – –

50–90

Глюкоза

–

0,1–0,3 г/л

75–92

61–130

Глюкуроновая

кислота

–

4,1–9,3

0,4–1,4

Холестерин

–

0,02–0,5 г/л

100–250

100–350

Фенолы

–

2,0–8,0

1,0–2,0

Желчные кисло-

ты

–

2,5–6,0

5,0–12,0

Лактаты

–

5,0–35

6,1–17,0

Стероиды

– – –

120–320

Неорганические соединения

Хлориды

6,0–9,0

5–31 ммоль/л

280–320

340–380

Фосфаты

1,0–5,0

5,5–

14 ммоль/л

6,0–15,0

12

Гидрокарбонаты

0–3,0

2–13 ммоль/л

–

120

Сульфаты

1,4–3,3

–

0,8–2,0

1,5–3,0

Натрий

4,0–6,0

6–23 ммоль/л

170–230

325–330

Калий

2,5–3,5

14–

41 ммоль/л

150–250

18–22

Кальций

0,01–0,3

1,2–

2,7 ммоль/л

5–11

9–11

Магний

0,17–0,28

0,1–

0,5 ммоль/л

2,0–4,0

1,6–2,2

Комплексы же-

леза

–

45–55

0,06–0,22

Обнаруженная для ряда ЛС (антипирин, изониазид, сульфаниламиды, ацетаминофен, парацетамол, фенитоин, кофеин, бензодиазепин карбамазепин, примидон, этосуксимид, теофиллин, дигоксин, хинидин, нитразепам, соли лития, морфин, метотрексат и др.) прямая зависимость между их содержанием в слюне и плазме позволяет использовать эту биожидкость для фармакокинетиче-

ских, биофармацевтических исследований, терапевтического лекарственного мониторинга, а также в исследованиях в области токсикологии и судебной медицины [334–341].

Литературный анализ выявил большое количество факторов, влияющих на динамику распределения ЛС в слюне:

1) физико-химические свойства ЛС (pKa, растворимость в липи-

дах, коэффициент связывания с белками);

2) способ отбора образцов, загрязнения образцов;

3) физиологические факторы (pH слюны, заболевания ротовой

полости).

Также некоторые авторы указывают на необходимость использования стимулирующих веществ для сбора слюны, однако известно, что стимуляция слюноотделения изменяет динамику распределения ЛС в слюне. Поэтому в настоящем исследовании пробы слюны отбирались у здоровых добровольцев без стимуляции слюнных желез в стерильные пробирки [339, 341, 342].

Слюна является альтернативной матрицей для анализа ЛП, который предоставляет преимущества как неинвазивной, быстрой, экономичной и простой процедуры, особенно у детей, пожилых пациентов, больных с хроническими болезнями (например, ВИЧинфекция и рак), расстройствами ЦНС (эпилепсия, депрессия), лиц с ограниченными физическими возможностями, лиц с бедным венозным доступом [337, 338].

Кроме того, при разработке и утверждении анализа ЛС в слюне внимание должно быть сосредоточено на правильном пробоотборе, обработке и хранении образцов с целью обеспечения стабильности ксенобиотиков. Это касается плазмы, сыворотки крови и мочи.

Моча представляет собой один из наиболее информативных объектов анализа, поскольку большинство ЛС выводится из организма с мочой. В этом случае моча является более подходящим объектом анализа. Необходимо отметить, что анализ мочи осложняется рядом факторов. Одним из них является изменение pH среды с течением времени из-за действия бактериальной флоры, выделяющей аммиак. Другими фактором является наличие в составе мочи низкомолекулярных продуктов метаболизма аминокислот и сахаров (аминов, карбоновых кислот и др.), небольших количеств пептидов и сахаров, стероидов и пигмента уробилина, окрашивающего мочу в желтый цвет. У людей с почечной или печеночной недостаточностью, а также с другими серьезными заболеваниями в моче могут появляться в больших количе-

ствах такие компоненты как белок, биллирубин, кетоновые тела и др. Отметим, что многие, ЛВ связаны с белком или конъюгированы с глукороновой кислотой). Чтобы разрушить коньюгат, образец мочи иногда необходимо подвергать гидролизу [343–345].

При этом на практике больше чем 80 % времени анализа занимает сбор образцов и их пробоподготовка. Процесс пробоподготовки для биологических жидкостей протекает, как правило, в две стадии: удаление белков и экстракция ЛС и их метаболитов в биологических жидкостях рациональными методами.

Сыворотка крови содержит белки (70–80 мг/мл), минеральные соли (около 7,5 мг/мл), липиды (4–8 мг/мл). Кроме этого, в ней содержится большое количество низкомолекулярных органических веществ, которые потенциально могут мешать проведению анализа: гормоны, биогенные амины, витамины, креатин, креатинин, билирубин, мочевая кислота и др. Показано, что при прямом введении сыворотки крови в колонку с обращенной фазой присутствующие в ней белки, липиды и некоторые другие компоненты вызывают заметное уменьшение эффективности колонки, а осаждение этих веществ на поверхности сорбента и на фильтрах колонки резко повышает ее гидродинамическое сопротивление. Такой подход в настоящее время не используется [346].

Современные методы подготовки биологических проб направлены либо на удаление мешающих компонентов (осаждение белка) с последующим анализом супернатанта, либо на извлечение определяемого вещества из биологической матрицы (методы экстракции).

Методы осаждения белка из биологических образцов включают методы использования растворителей (хлороформ, ацетон, ацетонитрил, метанол, этанол, изопропанол, метанол–этанол, диэтиловый эфир), кислот (муравьиная кислота, хлорная кислота или трихлоруксусная кислота), методы использования неорганических солей (сульфат аммония 3M, ацетат свинца или сульфат цинка 10–20 %) в сочетании с ультразвуком [347, 348].

Метод осаждения белков используется или как самостоятельный метод подготовки пробы, или как промежуточная стадия для других методов. Эта простая, быстрая и недорогая процедура, и поэтому она довольно распространена при подготовке проб биологических жидкостей, содержащих белки. Кратность разбавления образца при добавлении осадителя варьируется от 1 до 5, чаще 2–3, а степень извлечения определяемого вещества обычно находится в интервале 90–100 %. По-

сле центрифугирования надосадочную жидкость (супернатант) вводят в хроматографическую систему. Достаточно часто для повышения чувствительности супернатант упаривают досуха, сухой остаток растворяют в подходящем растворителе или в самой ПФ и инжектируют в колонку [345, 349, 350].

Наиболее удобным реагентом для осаждения белков с последующим анализом супернатанта методом ВЭЖХ с УФ-детектированием является ацетонитрил – он используется авторами в подавляющем большинстве работ. Высокое содержание ацетонитрила в образце (50 % и выше) снижает эффективность колонки с ОФ, что наиболее заметно при анализе гидрофильных веществ. Для решения этой проблемы применяют экстракцию ацетонитрила из супернатанта хлороформом или хлористым метиленом Кроме того, ацетнитрил при этом экстрагируется и липиды. Такой простой прием позволяет повысить эффективность колонки, увеличить чувствительность анализа и, что особенно важно, продлить «время жизни» колонки вследствие удаления липидных компонентов пробы.

После осаждения белка в пробе остается довольно большое количество эндогенных компонентов, которые мешают при анализе проб с низкими концентрациями ЛВ. Кроме этого, в пробе остаются высокогидрофобные компоненты сыворотки, которые поздно элюируются и тем самым удлиняют время анализа. Более того, они могут вообще не элюироваться и аккумулироваться в колонке при каждом введении проб, постепенно снижая ее эффективность. Однако, несмотря на все вышеперечисленные недостатки, осаждение белка с последующим инжектированием супернатанта остается наиболее широко используемым методическим приемом в фармацевтической химии.

Экстракция биологических образцов перед инжекцией в хроматографические системы (ГХ, ГХ-МС, ВЭЖХ, ЖХ-МС) предусматривает обогащение, очистку, элиминирование мешающих компонентов и предотвращение загрязнения аналитических колонок и ферментативной деградации аналита. При этом широко применяются жидкожидкостная экстракция, твердофазная экстракция, твердофазная микроэкстракция и жидкофазная микроэкстракция, особенно в пробоподготовке биологических образцов при проведении биофармацевтического анализа.

Процессы экстракции анализируемых ЛВ и их метаболитов из биологических объектов осуществляют с помощью таких органических растворителей, как диэтиловый эфир, хлороформ, бензол, ди-

хлорэтан, дихлорметан, н-гексан, н-гептан, метиленхлорид, этилацетат, ацетон. Нередко сочетают в экстрагенте два из указанных растворителей. Такой способ называют двухфазным экстрагированием. Наилучшая полнота разделения достигается, если последовательно извлекают ЛВ или их метаболиты из биологической жидкости несколькими растворителями, например эфиром, этилацетатом, хлороформом, ацетоном, водой. Экстракцию проводят в присутствии кислот, щелочей или буферных растворов, создавая рН среды, оптимальное для извлечения ЛВ или его метаболита [351].

Следовательно, биофармацевтический анализ представляет собой своеобразный инструмент, необходимый для проведения не только биофармацевтических, но и фармакокинетических исследований. Требования, предъявляемые к методам количественного определения ЛС в биологических жидкостях с учетом специфики анализа, отличаются от требований при определении ЛС в субстанциях и лекарственных формах.

Большое значение имеет выбор аналитического метода проведения биофармацевтического анализа при фармакокинетических исследованиях. Используемый метод должен иметь высокую чувствительность (чтобы он позволял достоверно и точно определять в 10 раз меньшее количество, чем среднее количество вещества, всасывающееся после приема однократной дозы), возможность работы с малыми объемами проб, большую специфичность и избирательность (чтобы определять неизменившуюся часть ЛВ в присутствии его метаболитов и эндогенных соединений), отличаться надежностью и воспроизводимостью, универсальностью (пригодностью для анализа различных ЛС), большой производительностью и возможностью автоматизации процесса анализа [352].

Несколько аналитических методов были применены для идентификации и количественного определения I фазы и II фазы лекарственного метаболизма, такие как спектрофотометрия, радиоиммунологический анализ (РИА), газовая хроматография/масс-спектрометрия (ГХ-МС) и ВЭЖХ, флюоресценция. В последнее время ЖХ–MС–МС стала идеалом для использования в анализе метаболитов вследствие ее специфичности, чувствительности и эффективности в сложных биологических матрицах [342, 353].

Необходимо отметить, что высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в настоящее время стала одним из самых мощ-

ных аналитических методов. Этот метод имеет перед другими существенные преимущества [354]:

– в методе ВЭЖХ отпадает характерные для ГЖХ ограничения по термоустойчивости анализируемых соединений;

– для ВЭЖХ несущественны проблемы летучести анализируемого препарата;

– в большинстве случаев отпадает необходимость в получении производных, удобных для хроматографирования;

– в наиболее распространенном для фармакокинетического анализа методе ВЭЖХ (обращенно-фазный вариант) появляется возможность работать с водными растворами, что позволяет существенно сократить время анализа и упростить обработку биопроб;

– методы детектирования в ВЭЖХ более специфические, чем в ГЖХ, что повышает избирательность метода;

– практически все методы детектирования в ВЭЖХ являются неразрушаемыми (вещество при количественном определении не разрушается).

Поэтому ВЭЖХ чаще, чем ГЖХ используют для контроля качества продукции большинства фармацевтических фирм и зарубежных фармакопей. (по своим аналитическим характеристикам соответствует требованиям фармацевтического анализа для 80–90 % существующих препаратов).

Одним из самых избирательных и чувствительных методов анализа веществ на сегодняшний день является хроматомассспектрометрия (комбинация ГХ, ВЭЖХ с масс-спектрометром (МС) или ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометром (МС–МС). При этом предел количественного определения в ВЭЖХ–МС–МС колеблется между 0,01 и 5 нг/мл лекарства в биологических образцах, что вполне достаточно в количественном анализе лекарственных метаболитов. Подробно использование систем ГХ–МС, ВЭЖХ–МС или ВЭЖХ– МС–МС рассмотрено в работах [342, 355, 356].

Большие возможности в биофармацевтическом анализе открывает применение радиоактивных изотопов. В последние годы стали применять стабильные изотопы, абсолютно безвредные для живого организма в количествах, необходимых для эксперимента. Стабильные изотопы можно долго хранить, так как они в отличие от радиоактивных изотопов не распадаются. Радиохимические методы отличаются высокой чувствительностью и в сочетании с хроматографией дают возможность выявить все вещества с радиоактивной меткой. Ис-

пользование меченых молекул позволяет установить распределение и локализацию введенного JIB и метаболитов во всех системах организма с большой специфичностью и чувствительностью. В результате можно получить четкое представление о процессе транспорта и выведения из организма этих веществ. Принципы этих методов и особенности применения подробно рассмотрены в работах [367, 358].

В последние годы для определения малых концентраций ЛВ и их метаболитов в биологических жидкостях (крови, моче, тканях), а также для изучения метаболизма и проведения фармакокинетических исследований применяют иммунохимические методы, основанные на взаимодействии специфических белковых антител с анализируемым веществом, выступающими в роли антигента. Это радиоиммунный и иммуноферментный методы. Принципы этих методов и особенности применения подробно рассмотрены в работе.

Метод ЯМР позволяет обнаруживать и одновременно количественно определять много компонентов, в том числе важнейшие метаболиты и биомаркеры, и тем самым осуществляет достаточно полную диагностику организма [359].

100

Глава 8. СВЯЗЬ СКОРОСТИ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ

С РАЗЛИЧНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

Большие трудности в интерпретации данных и вместе с тем особый интерес представляют случаи обнаружения связи ацетиляторного полиморфизма с различными заболеваниями, когда при той или иной патологии наблюдается преобладание того или иного фенотипа. Такого рода ассоциации могут быть отражением трех типов причинноследственных отношений [360]:

– определенный генетически детерминированный ацетиляторный фенотип является прямой или косвенной причиной заболевания;

– патологические механизмы прямо или косвенно обусловливают определенный сдвиг ацетиляторного фенотипа с изменением или без изменения собственно активности ацетилтрансферазы;

– могут существовать факторы, независимым образом обусловливающие изменения ацетиляторного статуса и состояние здоровья, так что эти признаки коварьируют.

Фенотип ацетилирования используется в качестве маркера предрасположенности к определенным заболеваниям. В настоящее время установлена связь ацетиляторного статуса с некоторыми патологиями и последствиями приема ЛП. Ряд исследователей изучали эффективность и безопасность фармакотерапии у пациентов в зависимости от фенотипа ацетилирования. Бимодальное распределение популяции по активности NAT2 и независимость этой характеристики от возраста позволяет использовать ее в качестве маркера при оценке предрасположенности человека к заболеваниям и особенностей их течения. К настоящему времени проведено достаточно много исследований по изучению связи статуса ацетилирования и с риском развития различных заболеваний. Результаты части этих работ свидетельствуют о наличии ассоциаций между статусом ацетилирования NAT2 и заболеваниями (табл. 8.1).

У больных сахарным диабетом 2 типа преобладает быстрый фенотип ацетилирования (62 %) в сравнении со здоровыми добровольцами (45 %). Скорость ацетилирования имеет тенденцию к увеличению с возрастанием длительности сахарного диабета 2 типа, декомпенсации углеводного обмена и с прогрессированием диабетической нефропатии. Быстрый фенотип ацетилирования имеет положительную корреляционную связь с содержанием этаноламина в моче и крови, а также щавелевой кислоты в моче у больных сахарным диабетом 2 типа [100–103].

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 8 910 / 1510 11 12 13 14 15 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]