Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Репродуктивная биотехнология. Учебно-методическое пособие
.pdf
тающих вне живого организма (in-vitro) имеет боль-
шое значение для решения ряда научных задач и
практических вопросов по повышению эффективно-
сти разведения животных.
В настоящее время не разработаны методы ис-
пользования всего запаса ооцитов в яичниках жи-
вотных, но значительное число ооцитов может быть
получено из полостных фолликулов для дальнейше-
го их созревания и оплодотворения вне организма.
Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих
in-vitro включает следующие этапы:
1.Созревание ооцитов in-vitro.
Явление спонтанного возобновления мейоза ооцитов, выделенных из фолликулов кролика и помещенных в культуральную среду, было впервые от-
крыто Г. Пинкусом и Н. Энзманом в 1935году.
Известно, что после выделения ооцита из фолликула, как и после выброса эндогенного ЛГ в орга-
низме животного перед овуляцией, ооцит ос-
вобождается из состояния мейотического торможения, что сопровождается так называемым разрывом
зародышевого пузырька. В организме крупного рогатого скота разрыв зародышевого пузырька происходит примерно через 5 ч после выброса ЛГ, ооцит
достигает метафазы I через 12 ч и метафазы II через
24—25 ч.
31
Хотя большинство ооцитов, извлеченных из
фолликулов яичников, также возобновляют мейоз и
достигают метафазы II, оплодотворение их часто не
обеспечивает полноценного развития зародышей.
Предполагают, что основной причиной этого являет-
ся неполноценное созревание ооцитов.
Неполноценное созревание ооцитов может быть
связано тем, что при созревании ооцита in-vitro в ци-
топлазме не вырабатывается в достаточной мере
фактор, контролирующий формирование и развитие
мужского пронуклеуса. Считают, что для появления
в цитоплазме этого фактора необходимо обеспечить
индуктивное влияние нормального окружения ооцита в фолликуле в течение не менее 6 ч после начала
мейотического созревания.
В связи с тем что стероидные гормоны и другие
факторы, вырабатываемые фолликулярными клетками, оказывают влияние на созревание ооцитов, было
сделано предположение, что культивирование ооцитов с фолликулярными клетками может повысить их
способность к нормальному оплодотворению и последующему эмбриональному развитию. Многие явления внутри фолликула, включая биосинтез стероидов и синтез белков, регулируют гонадотропные
гормоны. Поэтому при культивировании ооцитов
внутри фолликулов или с фолликулярными клетками
32
гонадотропины должны быть обязательной состав-
ной частью среды.
Необходимость прямого контакта между соматическими (фолликулярными) клетками и половыми
клетками обусловлена целым рядом причин. Фолликулярные клетки играют важную роль в питании ооцита. Они обеспечивают энергетический субстрат
ооциту, участвуют в переносе некоторых предшественников аминокислот, нуклеотидов и фосфолипидов в ооцит, генерируют инструктивные сигналы,
которые влияют на ядре и прямой синтез определенных структурных белков.
В настоящее время применение на практике
нашло созревание invitro только ооцитов крупного
рогатого скота. Ооциты получают из яичников коров
после убоя животных иили путем прижизненного
извлечения, 1—2 раза в неделю. В первом случае
яичники берут от животных после убоя, доставляют
в лабораторию в термостатированном контейнере в
течение 1,5—2,0 ч., где их дважды промывают свежим фосфатным буфером. Ооциты извлекают из
фолликулов путем отсасывания или разрезания яичника на пластинки, собирают в среду ТСМ 199 с до-
бавлением 10 % сыворотки крови от коровы в охоте,
затем дважды промывают и отбирают для дальней-
шего созревания in-vitro.
33
В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с
помощью ультразвукового прибора или ла-
пароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр которых не менее 2 мм, 1—2 раза в
неделю от одного и того же животного. В среднем
получают однократно 5—6 ооцитов на животное.
Однако, как правило, не более 50 % ооцитов только
бывают пригодны для созревания in-vitro. Достоин-
ством данного метода является то, что несмотря на
низкий выход ооцитов сохраняется возможность
многократного использования животного.
Отобранные ооциты с компактным кумулюсом
созревают в течение 24 ч в среде ТСМ 199 с добав-
лением 20 %-ной обработанной сывороткой крови от
коровы в охоте, гранулезных клеток (3—5 • 10
6
кле-
ток в 1 мл) и небольшого количества антибиотиков
(пенициллина, стрептомицина).
2. Капацитация сперматозоидов.
Важным этапом в разработке метода оплодотворения у млекопитающих было открытие явления
капацитации спермиев. В 1951 г. М.К. Чанг и одновременно с ним Г.Р. Аустин установили, что оплодотворение у млекопитающих наступает только в том
случае, если спермии в течение нескольких часов до
овуляции находятся в яйцеводе животного. Основы-
34
ваясь на наблюдениях по изучению проникновения
спермиев яйцеклетки крысы в различные сроки по-
сле спаривания Аустин ввел термин капацитации.
Он означает, что в спермии должны произойти некоторые физиологические изменения до того, как
сперматозоид приобретет способность к оплодотво-
рению.
Капацитация включает две фазы:
1) изменение мембраны спермия (собственно
капацитация);
2) акросомная реакция, т.е. реакция, которая
происходит в акросоме сперматозоидов по мере их
приближения к яйцеклетке.
В естественных условиях сперматозоиды достигают оплодотворяющей способности в нижних отде-
лах половых путей самцов.
В половых путях самки после эякуляции спер-
матозоиды подвергаются изменениям, известным
под названием капацитации. Эти изменения включают в себя: 1) приобретение сперматозоидами способности к акросомальной реакции, позволяющей
осуществить слияние с оолеммой и 2) тонкие изменения в характере биения жгутика (сверхактивная
подвижность).
Биохимия капацитации выяснена еще недоста-
точно. К факторам декапацитации, смываемых с по-
35
верхности спермиев в женском репродуктивном
тракте относят гликопротеин с молекулярным весом
37000, сиалопротеины и ингибиторы специфических
ферментов. С мембраной сперматозоидов могут свя-
зываться лактатдегидрогеназа, цАМФ, b-
субъединица ХГ, стероиды, иммуноглобулины, компоненты комплемента, катехоламины. То, что капацитация у млекопитающих, в том числе у человека,
не зависит от каких-либо факторов яйцеклетки, и
время капацитации значительно колеблется у различных спермиев, является важным приспособлени-
ем к внутреннему оплодотворению.
Результатом капацитации является способность
спермиев к акросомной реакции, т.е. морфологическим изменениям акросомного колпачка, что является необходимым условием для оплодотворения у
млекопитающих. В результате акросомной реакции
происходит освобождение ферментов, облегчающих
прохождение спермиев через пояс клеток лучистого
венца и через прозрачную оболочку. В ходе акросомной реакции вначале начинает набухать передняя
часть акросомного колпачка. Затем происходит слияние наружной акросомной мембраны с плазматической, что ведет к вакуолизации, последующему
сбрасыванию колпачка и освобождению содержимо-
го акросомы.
36
С учетом всех особенностей в механизме, в
настоящее время разработаны следующие методы
капацитации спермиев:
- использование среды с высокой ионной силой;
- использование гликозаминогликана гепарина.
3. Оплодотворение in-vitro и обеспечение ранних
стадий развития эмбрионов.
Оплодотворение in-vitro проводят в капле мо-
дифицированной среды Тироида. После созревания
in-vitro ооциты частично очищают от окружающих
кумулюсных клеток и переносят в микрокапле по
пять ооцитов в каждой. Суспензия сперматозоидов
объемом 2 -5 мкл добавляется к среде с ооцитами,
чтобы достичь концентрации сперматозоидов в кап-
лях 1,0 -1,5 млн./мл. Через 44 - 48 часов после осе-
менения определяют наличие дробления ооцитов.
Затем эмбрионы помещают в монослой эпителиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5
дней.
6. Контрольные вопросы
1. Основные направления развития биотехно-
37
логии в животноводстве.
2. Основные направления развития репродук-
тивной биотехнологии.
3. Значение репродуктивной биотехнологии для
современного животноводства.
4. Основные этапы трансплантации эмбрионов.
5. Отбор доноров и реципиентов в транспланта-
ции эмбрионов.
6. Способы вызывания суперовуляции и искус-
ственное осеменение.
7. Методы извлечения эмбрионов.
8. Методы оценки качества эмбрионов.
9. Кратковременное хранение и культивирова-
ние эмбрионов.
10. Пересадка эмбрионов реципиентам.
11. Методы консервации эмбрионов. Криокон-
сервация.
12. Оплодотворение яйцеклеток вне организма
животного. Основные этапы.
13. Созревание ооцитов.
14. Биохимические основы капацитации спер-
мотозоидов.
15. Понятие о экстракорпоральном оплодотво-
рении (ЭКО).
7. Список использованной литературы
38
1. Алимов А.М. Безопасность сельскохозяйственного
сырья и продовольствия / А.М.Алимов,
Т.М.Ахметов, Т.Р.Якупов, Ф.Ф Зиннатов,
Н.Р.Касанова // Казань: ФГБОУ ВО Казанская
ГАВМ, 2020. - 251 с.
2. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология. Москва «Высшая школа». 2003.- 469с.
3. Якупов Т.Р. Молекулярная биотехнология. Биоинженерия / Учебное пособие. Казань. – 2018. –
157с.
4. Якупов Т.Р. Биохимия. Учебное пособие. Казань.
– 2015. – 110с.
39
1. Общие методические рекомендации …
2. Введение …………………………………
3. Трансплантация эмбрионов ……………
3.1 Отбор доноров и вызывание суперо-
вуляции
3.2 Искусственное осеменение коров-
доноров
3.3 Извлечение эмбрионов.
3.4 Оценка качества, кратковременное
культивирование и хранение эмбрионов.
4. Консервация эмбрионов ………………
5. Оплодотворение яйцеклеток вне орга-
низма животного ………………………..
6. Контрольные вопросы ……………….
7. Список использованной литературы …
3
6
12
15
18
21
27
30
38
39
Содержание.
18
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]