Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Репродуктивная биотехнология. Учебно-методическое пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

06.09.2026

Размер:

550 Кб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 23 / 43 4 > Следующая >>>

Рис.1. Схема промывания матки крупного рогатого скота.

1 — флакон с физиологической средой; 2 — иглы; 3 — воздушный фильтр; 4 — шприц; 5 — двухпозиционный краник или клапанное устройство; 6 — трубки; 7 — сосуд для сбора смыва; 8 — безманжетный катетер, введенный в рог матки; 9 — шейка матки; 10 — рог матки, 11 — яичник (стрелками показано на- правление движения жидкости; А — место пережатия рога матки)

3.4 Оценка качества, кратковременное культи-

вирование и хранение эмбрионов.

Оценка качества эмбрионов производится несколькими методами:

а) Морфологический метод – при этом основное

внимание обращают на форму зиготы, равномер-

ность дробления и т.д.

б) Оценка по адсорбционным свойствам оболочек и цитоплазмы к различным красителям (напри-

мер, синьке Эванса).

в) Гистохимические методы –основаны на спе-

цифических реакциях структурных элементов и ве-

ществ клеток к различным красителям.

а) б)

Рис.2. Эмбрионы на стадии развития - морула, пригодные для трансплантации.

а) ранняя; б) поздняя

При оценке качества эмбрионов в нашей стране

принята 5-балльная шкала с учетом следующих по-

казателей: соответствие стадии развития эмбриона его возрасту; правильность формы прозрачной оболочки и ее целостность; состояние цитоплазмы и др. Наиболее пригодными для трансплантации являются

эмбрионы, которые извлечены из матки коровыдонора на 7 -8 сутки после первого осеменения.

Нормально развитые эмбрионы содержат непо-

врежденные равномерные по ширине опалесцирующие оболочки и цитоплазму в состоянии дробления, соответствующем возрасту эмбриона. Морула представляет собой скопление бластомеров не всегда

одинаковых по размеру из-за асинхронности дроб-

ления. Цитоплазма гомогенная, бластомеры имеют полигональную связь. Перивителлиновое простран-

ство свободно от гранул и включений

Кратковременное хранение и культивирование

эмбрионов

Манипуляции с ранними эмбрионами, находящимися на предимплантационных стадиях развития, т.е. от момента их получения до введения в рога матки реципиента, занимают от 1 до 5 часов. Поэтому применение метода трансплантации эмбрионов потребовало разработки эффективных методов их хранения в период между извлечением и пересадкой. В этот период нужно создать оптимальные условия, обеспечивающие сохранение их биологических ка-

честв. Кратковременное хранение эмбрионов дает

также возможность транспортировать их в другие

хозяйства.

В настоящее время разработаны различные ме-

тоды краткосрочного хранения эмбрионов in-vitro. Известны способы хранения эмбрионов используя

фосфатный буфер с некоторыми модификациями при добавлении эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и при комнатной температуре или

температуре 37°С. Применяются способы хранения в специальных питательных средах, в состав которых

включены растворы солей и аминокислот с бикарбонатным ионом как буферным агентом. Они обеспечивают рН в пределах 7,2 -7,6 и при этом сохраняют жизнеспособность эмбрионов до 95 часов.

Последние можно отнести и к способам культи-

вирования эмбрионов.

Выживаемость эмбрионов при хранении может быть увеличена охлаждением их ниже температуры тела. Чувствительность эмбрионов к охлаждению за-

висит от вида животного.

Эмбрионы свиней особенно чувствительны к охлаждению. Пока не удалось сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на ранних стадиях раз-

вития после охлаждения их ниже 10—15°С. Эмбри-

оны крупного рогатого скота на ранних стадиях развития также очень чувствительны к охлаждению до 0°С. Однако на более поздних стадиях развития, таких как морула или бластоциста, они хорошо вы-

держивают охлаждение. Эмбрионы овец хорошо пе-

реносят охлаждение до 0°С на любых стадиях разви-

тия, от одно-, двухклеточной стадии до бластоцисты.

Понижение температуры хранения эмбрионов от 37°С до 10° и 0°С угнетает или останавливает их развитие, но обменные процессы протекают на

уровне, обеспечивающем хранение до 5—6 сут.

Эмбрионы КРС можно сохранить путем пере-

садки их в яйцепровод самок других видов млекопи-

тающих, например, крольчих. Недостаток метода –

трудоемкость и возможные потери зигот при их пе-

реносе.

Культивирование зародышей.

Культивирование осуществляется прежде всего с целью выявления жизнеспособности эмбриона.

Для культивирования необходим термостат, точно выдерживающий температуру 37°С, пипетки для манипуляций с эмбрионами, часовые стекла или пробирки, чашки Петри и другая необходимая посуда для работы с эмбрионами, а также приборы мик-

роскопического контроля.

В качестве сред для культивирования заро-

дышей используют среды: ТС-199, Хема, Г-10, Игла,

солевые растворы Дюльбекко, Бринстера с различными биологическими и синтетическими добавками. Культивирование эмбрионов можно проводить в 0,2 мл питательной среды в часовых стеклах под слоем стерильного вазелинового масла (25 капель). Часовые стекла помещают в чашки Петри и содержат в эксикаторе при 37°С в термостате. Можно использовать более простой метод культивирования эмбрио-

нов в пробирках и соломинах.

После культивирования эмбрионов проводят оценку их жизнеспособности под микроскопом. Эм-

брионы, развившиеся соответственно ожидаемой стадии и получившие по морфологическим показа-

телям оценку 5, 4 или 3 балла, считают пригодными для пересадки.

3.5 Пересадка эмбрионов реципиентам.

В качестве реципиента отбирают гинекологиче-

ски здоровых коров после двух-трех нормальных

половых циклов; продуктивные, племенные и породные качества роли не играют. Основное условие хорошего приживления эмбрионов –синхронность проявления половой охоты у доноров и реципиентов. В настоящее время пересадка эмбрионов реципиен-

там производится следующими способами:

 Хирургический способ – его эффективность 60 -70 %, а число телят –3 - 4 на донора. Этот способ

использовали в основном до середины 70-х годов.

Однако он требует больших затрат, его трудно при-

менять в производственных условиях. Из-за возможных травм его нельзя многократного использовать.

 Нехирургический способ – прост, экономичен,

возможно многократное использование реципиента. Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Метод основан на введении эмбриона в рог матки через шейку. Эффективность трансплантации повышается при пересадке двух эмбрионов, по одному в каждый рог матки. Это позво-

ляет получить двойные отелы. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог матки частота двоен со-

ставляет 55 - 60 %, а при естественном многоплодии

коров –всего 2 %. Также можно пересаживать эмбрион и оплодотворенной корове. При этом прижив-

ляемость эмбриона составляет 50 %.

4. Консервация эмбрионов.

Для длительного хранения эмбрионов необходимо не только затормозить их развитие, но и значительно снизить или полностью остановить обменные процессы. Такое состояние эмбрионов достигается

при очень низких температурах. Поэтому, самым эффективным методом консервации эмбрионов счи-

тается глубокое замораживание (криоконсервация) в

жидком азоте при температуре -196 ºС.

Долговременное хранение глубокозаморожен-

ных эмбрионов имеет преимущества:

а) пересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятия эмбрионов, поэтому нет необходимости в содержании больших групп реципиентов. В результате повышается рента-

бельность трансплантации;

б) возможно создание эмбриобанков от генетически ценных животных. Это важно для сохранения генофонда редких и исчезающих пород, при транс-

портировке эмбрионов. Выживаемость эмбрионов

составляет 90 %, а стельность коров-реципиентов после нехирургической пересадки находится 50 -55

%. Эмбрионы замораживают в пробирках 50×6 мм

или в ампулах вместимостью 1 мл. В них вносят 1 -4

эмбриона от одного донора и 0,4 мл раствора криопротектора (например, 10 % раствор глицерина). Затем ампулы запаивают на пламени газовой горелки.

Возможно два режима охлаждения:

1) Ампулы или пробирки охлаждают с 20 до - 6

ºС со скоростью 1 ºС в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0,3ºС в минуту и

погружают в жидкий азот.

2) Охлаждение от -7 до -35 ºС со скоростью 0,3 ºС в минуту; от -35 до -38 ºС со скоростью 0,1 ºС в минуту и погружение в жидкий азот.

Рис.3. Автоматический программный замора-

живатель УОП-1, для замораживания эмбрионов

1. морозильная камера; 2. блок автоматики; 3. сосуд Дьюара с жидким азотом; 4. регистрирующий прибор; 5. электромагнитный клапан; 6. пробирки с

эмбрионами.

Оттаивание эмбрионов производится на водя-

ной бане с температурой 25 или 37 ºС в течение 10 -

12 секунд. Эксперименты последних лет позволили определить оптимальные соотношения между скоростью охлаждения и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. Установлено, что если эмбрионы охлаждают медленно (1°С/мин) до очень низкой

температуры (ниже -50°С) с последующим перено-

сом в жидкий азот, то они требуют и медленного от-

таивания (25°С/мин или медленнее). Быстрое оттаи-

вание таких эмбрионов может вызвать осмотиче-

скую дегидратацию и разрушение. Если эмбрионы замораживают медленно (1°С/мин) только до - 25 и

40°С с последующим переносом в жидкий азот, то их можно оттаивать очень быстро (300°С/мин). В этом случае остаточная вода при переносе в жидкий

азот трансформируется в стекловидное состояние.

5. Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного.

Большое число половых клеток в яичниках мле-

копитающих, в частности у крупного рогатого скота,

овец и свиней с высоким генетическим потенциалом, представляет источник огромного потенциала воспроизводительной способности этих животных в ускорении генетического прогресса по сравнению с использованием возможностей нормальной овуляции. У этих видов животных, как и других млекопитающих, число ооцитов, овулирующих спонтанно во время охоты, составляет только незначительную часть от тысяч ооцитов, находящихся в яичнике при

рождении животного. Остальные ооциты регенери-

руют внутри яичника или, как говорят обычно, подвергаются атрезии. Естественно возникал вопрос, нельзя ли выделить ооциты из яичников путем соответствующей обработки и провести их дальнейшее

оплодотворение вне организма животного.

Разработка системы оплодотворения и обеспе-

чения ранних стадий развития эмбрионов млекопи-

<<< < Предыдущая 1 23 / 43 4 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]