Хроматографические методы анализа. Учебное пособие

зов, применяют газ-носитель: аргон, воздух, азот, гелий, водород и др. Исследуемая смесь газов, передвигаясь вместе с газом-носителем вдоль колонки, разделяется на отдельные компоненты вследствие различной их адсорбируемости.

Газовая хроматография на модифицированном сорбенте основана на том, что неподвижной фазой служит твердый адсорбент, модифицированный небольшим количеством жидкости. В этом случае играют роль как адсорбция на твердом веществе, так и растворимость в модифицирующей жидкости.

3.Газожидкостная хроматография - разделение газовой смеси вслед-

ствие различной растворимости компонентов пробы в жидкости или различной стабильности образующихся комплексов. Неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на инертный носитель, подвижной - газ.

4.Распределительная хроматография - разделение веществ вслед-

ствие их различного распределения между двумя жидкими фазами, одна из которых неподвижна, а другая - подвижна. С количественной стороны это распределение характеризуется коэффициентами распределения между двумя растворителями. Применение твердого носителя обусловливается необходимостью сделать одну фазу неподвижной. В качестве неподвижной фазы чаще всего используют воду, реже - другие растворители.

5.Ионообменная хроматография - разделение веществ, основанное на обратимом обмене ионов, содержащихся в растворе, на ионы, входящие в состав ионообменника. Образование хроматограмм при этом происходит вследствие различной способности к обмену ионов хроматографируемого раствора. В качестве элюента (вымывающего вещества) применяют растворы электролитов. Для вымывания анализируемых веществ из колонки применяют различные способы обработки хроматограмм.

6.Осадочная хроматография - разделение веществ вследствие образования малорастворимых осадков в определенном порядке, который обусловливается их растворимостью. По мере фильтрации раствора через осадочнохроматографическую колонку, содержащую осадитель, многократно повторяются элементарные процессы образования и растворения осадков, что обеспечивает разделение веществ. Растворимость осадков и произведение растворимости (или активности), как характеристика этого свойства осадков, выступает как основной закон осадочной хроматографии. Возможность повторения элементарного процесса обеспечивается закреплением осадков в месте их образования, в противном случае осадки будут сползать вниз по колонке и хроматограмма не образуется.

7.Редокс-хроматография - разделение веществ вследствие неодинаковой скорости окислительно-восстановительных реакций, протекающих в колонке. Разделение веществ обусловлено соответствующими редокспотенциалами реагирующих веществ. Колонку, содержащую восстановитель, называют восстановительной, содержащую окислитель - окислительной. При хроматографировании раствора восстановителей на окислительной колонке зоны располагаются сверху вниз в порядке возрастания их окислительно-

21

восстановительных потенциалов, на восстановительной - наоборот.

8. Адсорбционно-комплексообразовательная хроматография - разде-

ление веществ вследствие различия в константах устойчивости соответствующих комплексных соединений, образующихся в колонке. В качестве носителя используют сорбент, удерживающий комплексообразователь и продукты его реакции с исследуемыми веществами. Образующиеся комплексные соединения поглощаются носителем вследствие большой прочности связи между молекулами комплекса и поверхностью носителя. В качестве комплексообразующих реагентов применяют диметилглиоксим, 8-оксихинолин, таннин и др.

22

РАЗДЕЛ 2. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ.

2.1. Исторические сведения, сущность, достоинства, области применения метода.

Распределительная хроматография - разделение веществ вследствие их различного распределения между двумя жидкими фазами, одна из которых неподвижна, а другая - подвижна.

Исторические сведения. В 1943 г. Мартин, Консден и Гордон использовали для анализа малых количеств аминокислот фильтровальную бумагу в качестве носителя неподвижной водной фазы, а в качестве подвижной фазы - смесь органического растворителя с водой. Благодаря применению этого метода стало возможным разделение близких по свойствам аминокислот, что привело к решению многих проблем в химии белка.

Сущность метода

Метод распределительной хроматографии основан на различном распределении хроматографируемых веществ между двумя несмешивающимися жидкостями. При этом пористое вещество удерживает на своей поверхности только одну из жидкостей, которая служит неподвижным растворителем. Вторая жидкость, не смешивающаяся с первой, играет роль подвижного растворителя, пропускаемого через колонку с небольшой скоростью. То есть компоненты смеси перемещаются через пористую неподвижную фазу под влиянием движущейся жидкости или газа, называемых подвижной фазой.

Преимущества:

•легкость; • быстрота исполнения.

Преимущества перед экстракцией:

•за счет динамического проведения опыта удается получить разделение близких по свойствам элементов без многократного повторении процесса экстракции; • аппаратурное оформление метода гораздо проще, чем экстракционного; • используется незначительное количество экстрагента.

Преимущества перед ионообменной хроматографией:

•носители, применяемые в этом методе, бесцветны (целлюлоза, фторо- пласт-4 и т.д.), поэтому можно легко наблюдать окрашенные зоны в колонке;

•тонкая поверхностная пленка органического растворителя обладает высокой способностью связывать большие молекулы, которые часто не могут проникнуть в сложную структуру смолы; • широкий выбор экстрагентов с избирательными свойствами.

Области применения:

• Разделения близких по свойствам органических веществ. Например, разделение многочисленных аминокислот, образующихся при гидролизе белка, разделение и определение родственных алифатических спиртов и разделение сахаров; • Разделение неорганических веществ с очень близкими химическими свойствами. Например, разделение редкоземельных металлов; • Концентрирование элементов; • Разделение цис-транс-изомеров неорганических комплексных солей; • Анализ гербицидов; • Анализа объектов окружающей среды: воздуха, почвы, воды и т.д. в целях предотвращения их загряз-

23

нения.

2.2.Носители и растворители в распределительной хроматографии Силикагель образует довольно прочно прилипающий к пластинке слой

ипригоден для разделения не слишком гидрофильных веществ. Также применяют оксид алюминия, кизельгур, гипс, целлюлозу, в последнее время - ионообменные смолы, силикат магния, гидроксид кальция и др. Подвижной фазой может служить чистый растворитель или смесь растворителей, которые в заметной степени не смешиваются с неподвижной фазой. К таким растворителям относятся малополярные жидкости: пентанол или бутанол, ацетон и др. Повысить эффективность разделения иногда можно непрерывным изменением состава смешанного растворителя по мере продвижения элюента.

Элюированием называется процесс вымывания из колонки растворенного вещества пропусканием чистого растворителя. В некоторых случаях разделение улучшается, если элюирование проводят рядом разных растворителей

Выбор подвижной фазы. Подвижную фазу выбирают главным образом эмпирически. Для ее выбора можно применять микроциркулярный способ. На стеклянную пластинку с носителем несколько проб одной и той же исследуемой смеси веществ наносят на расстоянии 2 см друг от друга. Через несколько минут после этого в центр каждой пробы наносят тонким капилляром растворитель; хроматограмму подсушивают и проявляют. Если пятно представляет собой четкое кольцо, разделение и выбор растворителя считаются наиболее удачными.

2.3.Стандартные условия проведения распределительной хромато-

графии

Для получения воспроизводимых результатов важно проводить эксперимент в стандартных условиях.

1) размер пластинок - 20 х 20 см; 2) толщина слоя носителя перед сушкой - 0,25 мм;

3) хранение пластинок в эксикаторах над растворителем; 4) линия старта должна отстоять от края пластинки на 1,5 см, а нанесен-

ные пробы друг от друга - на 1-2 см; 5) длина пути продвижения пятен - 10 см;

6) камеры должны быть насыщены парами растворителя;

7) пластинка погружается в растворитель на 0,5 см;

8) сорбенты должны быть строго стандартизированы;

9) необходима очистка растворителей; 10) следует иметь хорошо разделяемые эталонные вещества, по разделе-

нию которых можно выбирать условия хроматографирования.

2.4.Качественный и количественный анализ хроматограмм

После соответствующей обработки полученных хроматограмм можно проводить анализ смеси веществ и их идентификацию.

Качественный анализ хроматограмм осуществляется проявлением пятен подходящим проявителем. Для этого пластинку с хроматограммой

24

опрыскивают из пульверизатора раствором какого-нибудь реактива, дающего цветные реакции с разделяемыми веществами. Опрыскивание нужно проводить осторожно, чтобы не нарушался слой сорбента и не изменялась форма пятна. После опрыскивания иногда подсушивают пластинку в сушильном шкафу. Проявленные пятна обводят острым предметом (иглой). Для обнаружения на хроматограмме пятен бесцветных веществ иногда опрыскивают хроматограмму растворами реагентов, дающих с разделяемыми ионами флюоресцирующие соединения.

Количественный анализ осуществляют непосредственно на слое, или анализируемое вещество (пятно) вымывают из слоя сорбента и анализируют либо одним из физико-химических методов, либо методом газовой или жидкостной хроматографии.

Количественный анализ непосредственно на слое сорбента можно осуществлять по размеру пятна, так как площадь пятна зависит от количества определяемого вещества, активности сорбента, от толщины его слоя и объема наносимого раствора. Поэтому для сравнения на эту же пластинку наносят известные количества определяемого вещества. Площадь пятна определяют, как и в хроматографии, на бумаге.

После проявления пятен па хроматограмме окрашенные зоны компонен-

тов можно количественно охарактеризовать денситометрическим мето-

дом. С его помощью измеряются суммарная функция площади пятна и его интенсивность менее чем за 10 мин, однако в этом случае необходим прибор. Метод включает сканирование конечного пятна на хроматограмме пучком света. Отраженный или прошедший свет попадает на фотоумножитель, и разность в интенсивностях прошедшего и отраженного света измеряется по электрическому сигналу и записывается в виде хроматографических кривых, как при элюировании с колонки. Хроматограммы сканируют на двухлучевом саморегистрирующем и интегрирующем денситометре. Количество вещества определяют по градуировочным графикам, построенным в координатах «высота пика масса вещества в пятне». Массу вещества в пятне получают измерением площади под хроматографической кривой с использованием интегратора. Чтобы уменьшить ошибку, необходим тщательный подбор проявляющих реагентов: интенсивность окраски должна быть воспроизводима и пропорциональна количеству вещества.

Известны методы количественной флюориметрии тонкослойных хроматограмм без разрушения слоя, а также радиометрический метод, позволяющий с помощью специальной аппаратуры определять содержание элементов в зонах.

2.5. Разновидности распределительной хроматографии:

1.Хроматографическое разделение веществ в тонком слое носителя, нанесенного на пластинку, - тонкослойная хроматография (ТСХ).

2.Бумажная распределительная хроматография. В данном методе носителем неподвижного растворителя служит очищенная от примесей фильтровальная бумага.

25

3.Газожидкостная распределительная хроматография.

4.Капиллярная распределительная хроматография.

5.Колоночная распределительная хроматография.

2.6.Тонкослойная хроматография Историческая справка. Впервые этот метод применили советские уче-

ные Н.А. Измайлов и М.С. Шрайбер в 1938 г. для разделения алкалоидов. Несколько позднее было показано, что этот метод применим и для разделения неорганических ионов, например для разделения смеси железа и цинка. Позднее метод был развит немецким ученым Э. Шталем.

Сущность метода

ВТСХ хроматограммы получают в закрепленном или в незакреплен-

ном слое сорбента. Для обоих указанных способов применимы методы вос-

ходящей и нисходящей хроматографии.

Вкаждом варианте пластинку с нанесенными пробами помещают определенным образом в камеру для хроматографирования. После продвижения по пластинке растворителя на 10-15 см ее вынимают из камеры, отмечают линию фронта, сушат в сушильном шкафу или осторожно над электрической плиткой и проявляют полученную хроматограмму соответствующим раствором, как и в бумажной хроматографии.

Этапы приготовления пластинок с тонким слоем сорбента: выбор подложки, приготовление суспензии сорбента и нанесение его на подложку.

Преимущества TCX:

• простота оборудования; • высокая селективность разделения;• низкие пределы обнаружения близких по свойствам веществ.

Недостатки:

• по сравнению с ионообменной хроматографией является трудность выбора инертного носителя, который позволял бы вести процесс по чисто экстракционному механизму; возможность работать только с малыми количествами вещества (порядка 0,1 мкг), так как при больших его количествах пятна на хроматограмме получаются расплывчатыми и с растянутыми «хвостами»; ограниченность.

Область применения

Обнаружение и полуколичественное определения следов синтетических пестицидов. Например, хлорорганические пестициды разделяют в тонких слоях оксида алюминия или силикагеля, закрепленных гипсом. Пятна пестицидов обнаруживают, опрыскивая пластинки специальными реактивами. Чувствительность метода ~5 мкг.

Тонкослойная хроматография позволяет, например, обнаружить 30 мкг гексахлорана в 1 л виноградного сока.

Направления развития ТСХ

• Аналогично колонке в жидкостной хроматографии через пластинку непрерывно пропускают поток подвижной фазы. Пластинка может быть снабжена детектором, что дает возможность количественно и качественно оценивать результаты анализа.

26

•В классическом варианте ТСХ процесс разделения и детектирования проводят отдельно. Для детектирования разделенные вещества извлекают из тонкого слоя сорбента (например, с помощью растворителей) и определяют их тем или иным физико-химическим методом.

•Перспективное направление - сочетание метода тех с газовой и жидкостной колоночной хроматографией.

•В последнее время существенно улучшаются качество адсорбентов для тех, способы приготовления пластин, накапливается экспериментальный материал по разделению многих компонентов.

•Применение компьютеров позволило создать экспрессный и точный метод высокоэффективной ТСХ (ВЭТСХ). Для количественного анализа применение позволяет полностью автоматизировать процесс детектирования.

•Радиальная ТСХ существенно ускоряет процесс разделения сложной смеси.

2.7.Бумажная хроматография

Бумажная хроматография - это вид метода распределительной хроматографии, в котором носителем неподвижного растворителя служит очищенная от примесей фильтровальная бумага.

Классификация в зависимости от направления движения:

•нисходящая бумажная хроматография (поток движется сверху вниз);

•восходящая бумажная хроматография (поток движется снизу вверх);

•радиальная бумажная хроматография (движение начинается из пятна и места нанесения капли).

Преимущества:

•высокая чувствительность (можно определить 10-20 мкг вещества с точностью 5-7%).

Недостатки:

•возможность работать только с малыми количествами вещества (порядка 0,1 мкг), так как при больших его количествах пятна на хроматограмме получаются расплывчатыми и с растянутыми «хвостами»; • перед ТСХ: разделение происходит медленнее, слой сорбента неустойчив к агрессивным реактивам.

Области применения:

•качественный анализ неорганических, органических и биохимических смесей.

Методика проведения

Каплю водного раствора анализируемого вещества (например, смеси катионов Fe3+, Cu2+ Со2+, Mn2+ и Ni2+) наносят пипеткой на бумажную полоску на расстоянии 1-2 см от ее конца. Подвешивают бумагу в закрывающейся стеклянной камере, иногда в эксикаторе или даже просто в пробирке. При этом конец бумажной полоски с нанесенным анализируемым веществом погружают в растворитель (например, в бутанол или в смесь ацетона с хлороводородной кислотой). Подвижный растворитель, перемещаясь вверх по бумаге, постепенно смачивает ее (восходящая хроматография). Одновременно в

27

том же направлении передвигаются компоненты смеси, но с различными скоростями.

По прошествии времени, достаточного для разделения ионов, бумагу высушивают и опрыскивают (из пульверизатора) реактивами, образующими с разделяемыми ионами окрашенные соединения. Например, ионы Fe3+ и Cu2+ дают окрашенные пятна с гексацианоферратом калия К4[Fе(СN)6], ионы Со2+ и Ni2+ - с рубеановодородной кислотой, ион Mn2+ - с раствором нитрата серебра. Таким образом, на бумаге выявляются зоны локализации ионов в виде окрашенных пятен. Все вместе они составляют хроматограмму ионов на бумаге, позволяющую судить о составе смеси. Зону Са2+ обычно выявляют на хроматограмме действием ализарина, а зоны Sr2+ и Ва2+ - действием родизоната калия.

Также можно вместо полосок бумаги применять круглые бумажные фильтры. В этом случае получают так называемые круговые хроматограммы. Кроме того, развитие хроматограммы можно вести в двух измерениях

(двумерная бумажная хроматография). В этом случае пробу наносят на угол квадратного листа бумаги. Затем проводят хроматографирование в одном направлении обычным способом. После испарения растворителя бумагу поворачивают на 90º и снова погружают в растворитель, но уже с другими свойствами. Этим методом часто разделяют вещества, неразделимые при помощи одного растворителя.

Способы определения компонентов пробы Определение по площади зон, полученных на хроматограмме, основа-

но на явлении насыщения слоя адсорбента или бумаги веществом. Каждый тип адсорбента имеет определенную емкость и не может адсорбировать 13 единице массы больше определенного количества вещества. При хроматографировании неадсорбированная часть вещества переходит в подвижную фазу и поступает на свободные участки адсорбента, где адсорбируется. Вещество распределяется на хроматограмме на площади, пропорциональной его массе. Зависимость между массой вещества q и площадью пятна S на хроматограммах носит нелинейный характер и является логарифмической:

S a lg q b ,

где а и b - коэффициенты.

В этом методе во избежание больших ошибок применяют стандартные растворы. Измерение площади проводят планиметром. Строят калибровочный график зависимости площади зон от массы стандарта и по графику определяют массу компонента в растворе пробы. Ошибка метода измерения площади зон достигает 5-10%, поэтому метод используют для ориентировочных анализов.

Измерение физических и физико-химических свойств зон на хроматограмме. Наиболее точен денситометрический метод определения ве-

ществ (ошибка 1-2%). В методе денситометрии производят измерение оптического поглощения проявленной хроматограммы сканирующим лучом в проходящем или отраженном свете на специальных приборах - денситомет-

28

рах. На денситограмме получают пики, площадь которых пропорциональна содержанию вещества в пятне. Построив с помощью стандартов калибровочный график, измеряют площадь пика компонента и по графику определяют его массу в пробе. Получает развитие также спектрофотоденситометрическое и флюориметрическое определение веществ на хроматограммах. В первом случае используют специальные спектрофотоденситометры, измеряющие поглощение вещества в монохроматическом свете, во втором измеряют флюоресценцию пятна при облучении хроматограммы ультрафиолетовым светом.

Экстрагирование зоны соответствующим растворителем и анализ экстракта. При применении этого способа на хроматограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. После получения хроматограммы производят ее обработку, детектируя зону стандарта, вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и производят его экстрагирование подходящим растворителем. Полученный раствор анализируют инструментальным методом, имеющим высокую чувствительность. Чаще всего применяют спектрофотометрические и фотоколориметрические методы. Если вещество не имеет цвета или не обладает поглощением в ультрафиолетовой области, с экстрактом проводят фотометрическую реакцию, позволяющую получить интенсивно поглощающее производное вещество.

2.8.Гельпроникающая хроматография

Гельпроникающая хроматография (ГПХ) - это метод разделения мо-

лекул, основанный на различии их размеров. Другое его название - гельхроматография: эксклюзионная и молекулярно-ситовая хроматография.

В качестве неподвижной фазы в ГПХ используют частицы, имеющие определенные размеры пор. Подвижной фазой служат водные или органические элюенты.

Механизм разделения молекул в ГПХ. Молекулы анализируемых ве-

ществ распределены между неподвижным растворителем в порах сорбента и растворителем, протекающим через слой неподвижной фазы. Молекулы, которые имеют размеры, позволяющие им проникать в поры сорбента при движении вдоль колонки, часть времени теряют на пребывание в порах. Молекулы, имеющие размеры, превышающие размер пор, не проникают в сорбент и вымываются из колонки со скоростью движения элюента. Молекулы, которые проникают в поры всех размеров, движутся наиболее медленно. Снижение скорости движения веществ вдоль колонки тем больше, чем в большее количество пор способны диффундировать распределяемые частицы.

Преимущества:

•быстрота; • легкость исполнения.

Недостаток:

•ограниченность.

Сфера применения:

• качественный анализ различных смесей.

29

РАЗДЕЛ 3. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 3.1. Определение, разновидности, сущность, преимущества, области

применения Газовая хроматография (ГХ) - это хроматография, в которой происхо-

дит распределение компонентов анализируемой смеси между газообразной и твердой или жидкими фазами.

Разновидности газовой хроматографии (ГХ):

Газо-твердая хроматография (в установке используют твердый инертный пористый носитель).

Газо-жидкостная хроматография (носитель покрыт слоем жидкой фа-

зы).

Сущность метода

Пробу в виде пара вводят в колонку; компоненты, имеющие разную конечную растворимость в неподвижной жидкой или твердой фазе, распределяются между этой фазой и газом по закону равновесия. Элюирование осуществляется пропусканием через колонку какого-либо инертного газа, например азота или гелия. Скорость миграции разных компонентов зависит от их способности растворяться в неподвижной жидкой или твердой фазе. Компоненты с высоким коэффициентом распределения имеют низкую скорость продвижения. Наоборот, компоненты с низкой растворимостью в жидкой или твердой фазе мигрируют быстро. Качественная идентификация компонента основана на величине промежутка времени от момента ввода пробы до момента записи вершины пика; количественные данные получают, вычисляя площадь пика.

Преимущества:

•экспрессность;

•высокая точность;

•чувствительность;

•автоматизация

Области применения

Метод позволяет решить многие аналитические проблемы. Количественный ГХ анализ можно рассматривать как самостоятельный аналитический метод, более эффективный при разделении веществ, относящихся к одному и тому же классу (углеводороды, органические кислоты, спирты и т.д.). Этот метод незаменим в нефтехимии (бензины содержат сотни соединений, а керосины и масла — тысячи), его используют при определении пестицидов, удобрений, лекарственных препаратов, витаминов, наркотиков и др. При анализе сложных многокомпонентных смесей успешно применяют метод капиллярной хроматографии.

Реакционную газовую хроматографию часто используют при определении содержания микроколичеств воды. Вода реагирует с гидридами металлов, с карбидом кальция или металлическим натрием и др., продукты реакции (водород, ацетилен) детектируются с высокой чувствительностью пла-

30