Хроматографические методы анализа. Учебное пособие

R f Ll .

Величина Rf является индивидуальной характеристикой соединения, хроматографируемого в данном растворителе в условиях опыта, и изменяется от 0 до 1.

Рисунок 8 - Определение Rf (а) и разрешения R (б) хроматографических зон на пластине. Здесь l - расстояние от центра пятна до стартовой линии, W1 и W2 - диаметр пятен,

X - расстояние между центрами пятен

Оптимальным для практической тонкослойной хроматографии является интервал изменения Rf от 0,2 до 0,8. при Rf = О вещество не движется; при Rf = 1 вещество не задерживается неподвижной фазой и движется с фронтом растворителя.

Иногда для получения более надежных результатов подвижность соединений оценивают по отношению к подвижности вещества, выбранного в качестве стандарта или свидетеля (RfОПТ). Тогда

где Rfx и lx -подвижность и расстояние на хроматограмме, пройденное определяемым компонентом; Rfсв и lсв - подвижность и расстояние на хроматограмме, пройденное свидетелем.

В этом случае в отличие от Rf значение RfОПТ может быть больше едини-

цы.

Произведения D(As/Am) или KG(Wa/Vm) равны k' - фактору удерживания. Следовательно:

Откуда

1 R'

k' f ,

R'f

где 1 - R'f - количество растворенного вещества в неподвижной фазе; R'f - количество растворенного вещества в подвижной фазе.

11

1.5. Количественные характеристики разделения

Эффективность разделения как в газовой, так и в жидкостной хромато-

графии определяется числом теоретических тарелок N и высотой, эквива-

лентной теоретической тарелке - ВЭТТ (Н).

Распределение вещества вдоль слоя сорбента подчиняется уравнению

где x - расстояние от начала колонки до точки, концентрация в которой равна С, x0 - координата центра полосы, H- высота, эквивавалентная теоретической тарелке, l- длина слоя сорбента, на который произведено поглощение и размещено N теоретических тарелок, при этом

N Hl .

Контур хроматического пика описывается уравнением Гаусса:

где V - объем подвижной фазы, Vo - объем подвижной фазы, соответствующий Сmax, μст- стандартное отклонение, равное полуширине пика при

Если числитель дробного показателя степени в (1) и (2) выразить в одних и тех же единицах, то при сравнении этих уравнений получаем:

где w - ширина зоны в направлении движения элюента, L - длина колонки. Величина Н характеризует размывание хроматографической зоны, N - эффективность хроматографической пластины.

Разрешение R (разрешающая способность) двух хроматографических зон определяется расстоянием между их центрами (ΔХ), поделенным на среднеарифметическое из их ширин W1 и W2 (рис. 8):

Селективность разделения α в тонкослойной хроматографии рассчитывается по формуле

12

где D1 и D2 - коэффициенты распределения компонентов; Rf1 и Rf2 - подвижности компонентов.

Разрешающая способность (для двух соседних) зон определяется тремя факторами:

а) селективностью; б) структурой слоя сорбента;

в) средним значением Rf для разделяемой пары:

a

Это уравнение выведено Снайдером и является определяющим уравнением для описания и понимания процесса разделения в тонкослойной хроматографии.

Разрешение двух зон считается полным при R >1,5.

Для максимального разрешения оптимальным является значение R ≈ 0,3-0,5. Известно, что оптимальные условия хроматографирования могут быть выбраны на основании уравнения Ван-Деемтера, описывающего зависимость ВЭТТ (H) от скорости движения элюента (V). Модификацией этого уравнения является уравнение Нокса, которое устанавливает связь между приведенными величинами Н и V: приведенная ВЭТТ h = H/dp, приведенная скорость V = udp /Dm, где и - константа скорости, Dт - коэффициент диффузии хроматографируемого вещества в элюенте, dp - диаметр зерна носителя на пластине. С использованием приведенных величин h и v уравнение Нокса

приобретает вид:

h av 13 bv cv ,

где а, b, с - безразмерные экспериментальные коэффициенты, характеризующие качество структуры слоя (а), диффузию в подвижной фазе (b) и сопротивление массопередаче (с).

Это уравнение описывает кривую с минимумом (рис. 9), левая (крутая) ветвь которой связана в основном с размыванием зон за счет молекулярной диффузии, а правая (пологая) ветвь - с размыванием за счет неравномерности массопередачи.

13

где п - число компонентов смеси; Si - площадь хроматографического пика; ki - поправочные коэффициенты для каждого i - компонента.

Метод внутреннего стандарта предусматривает введение в анализируемый образец известного количества эталонного соединения, хроматографирование полученной смеси и расчет по формуле:

Ci (%) SSi kCВ.СТ , ,

В.СТ

где Сi - концентрация определяемого вещества; Si - площадь хроматографического пика;

- площадь хроматографического пика стандартного вещества; Св.ст - концентрация внутреннего стандарта, введенного в пробу;

k - поправочный множитель, который рассчитывают по стандартной смеси эталонного соединения и определяемого вещества по формуле:

k SВ.СТCi / SiCВ.СТ , ,

где i относится к определяемому веществу.

1.7. Сорбенты в хроматографии: требования к сорбентам, активность сорбента

В жидкостной и газовой хроматографии используются большое количество органических и неорганических сорбентов: силикагель; силикагель, модифицированный алкильными и другими группами; оксид алюминия, целлюлоза и модифицированная целлюлоза; силикат магния; ионообменные смолы; полиамид, а также смеси этих и других сорбентов.

Требования, предъявляемые к сорбентам:

1)не должны растворяться в подвижной фазе;

2)не должны химически реагировать с хроматографируемым веще-

ством;

3)не должны содержать компоненты, мешающие детектированию и разделению;

4)вещества, используемые для образования слоя, не должны быть окрашены.

Активность сорбента. Этот параметр в совокупности с другими свойствами сорбента, а также растворителем и температурой влияет на значения удерживания или подвижности анализируемого вещества. Увеличение активности слоя при постоянстве других параметров способствует снижению

Vr, или Rf, а уменьшение - повышению Vr или Rf.

Активность сорбента определяется вкладом энергии поверхности. Чем больше энергия поверхности, тем сильнее взаимодействие между сорбентом (поглощающее тело) и сорбатом (поглощаемое тело). Удельная поверхность сорбента (площадь поверхности на единицу массы сорбента) определяет количество сорбционных процессов, которые могут протекать одновременно. Величина поверхности, на которой при хроматографировании происходят сорбционные явления, снижается, если она покрыта молекулами «дезакти-

15

ватора», которые снижают «свободную», т.е. эффективную (активную), поверхность сорбента.

Дезактиваторами гидрофильных сорбентов (силикагеля и оксида алюминия) являются высокополярные вещества, например вода, для неполярных адсорбентов (уголь, графитовая сажа) - молекулы липофильных веществ (бензол, стеариновая кислота). Обращенные фазы могут быть дезактивированы тяжелыми углеводородами.

Важной процедурой является предварительная очистка сорбента, например, путем элюирования полярным растворителем или обработкой хромовой смесью с последующей отмывкой водой (для очистки пластин с силиказолевым связующим).

В зависимости от решаемой задачи перед внесением проб проводят модификацию сорбента различными реагентами для улучшения разделения.

1.8. Неорганические полярные сорбенты Силикагель - универсальный и наиболее распространенный сорбент в

нормально-фазовой хроматографии.

Получение. Он синтезируется из ортокремниевой кислоты, получаемой гидролизом силиката или его обработкой соляной кислотой.

Поверхность силикагеля содержит силанольные и силаксановые группы

(рис. 10):

Рисунок 10 - Типы функциональных групп в силикагеле:

а-свободные силанольные группы; б - геминальные (парные) силанольные группы; в

-вицинальные (соседние) силанольные группы; г - силоксановые группы

Силоксановые группы обладают протоноакцепторными свойствами, в то время как свободные, геминальные (парные) и вицинальные (соседние) силанольные группы действуют как доноры протонов и слабокислотные ионообменники. Дипольные свойства зависят от основной структуры силикагеля.

Свойства. Силикагель - это полярный сорбент с гидрофильными свойствами. Однако он растворяется в воде, образуя 0,01% раствор (t = 200С).

16

Гидролиз и растворимость существенно возрастают при рН = 9, так что основные проблемы возникают с силикагелем при продолжительном воздействии щелочных рН. При нагревании силикагеля до 150-2000С с его поверхности удаляется физически связанная вода. Если нагревать дальше, сорбент спекается: силанольные группы превращаются в силоксановые, удаляется химически связанная вода. При еще большем нагревании способность к связыванию воды полностью утрачивается. Поверхность силикагеля становится гидрофобной, а структура его подобна структуре силоксана.

Разновидности силикагеля:

модифицированный силикагель - вместо воды к нему добавляют растворы кислот, щелочей, буферных веществ;

силикагель Н без связующего вещества;

силикагель G с добавкой гипса;

силикагель «Бельм».

Способ приготовления. Силикагель многократно кипятят с новыми порциями HCl (1: 1) до отрицательной реакции на железо (III) с роданидом аммония и тщательно отмывают от хлорид-ионов дистиллированной водой (проба с АgNО3). Затем силикагель сушат в сушильном шкафу при 1200С в течение 24 - 48 ч и хранят в плотно закрытых склянках.

Активность силикагеля понижается при добавлении воды. Для получения носителя с нужной активностью к обезвоженному силикагелю добавляют соответствующее количество дистиллированной воды, встряхивают смесь в банке с притертой пробкой и оставляют на ночь. Кроме того, активность носителя зависит от зернения и от диаметра пор: чем меньше частицы, тем больше поверхностная активность.

Оксид алюминия - полярный сорбент, приготавливается дегидратацией гидроксида алюминия при t = 500 ºС. При нагревании происходит удаление воды с образованием структуры Al-O-Al, имеющей основные гидроксильные группы (рН = 7,5-8,0). Поэтому этот сорбент, как силикагель, может образовывать водородные связи. Однако протоноакцепторные свойства Аl2Оз гораздо сильнее, чем у силикагеля. Используется для хроматографического разделения кислот, спиртов или енолов, фенолов или аминосоединений. Более размытые зоны следует ожидать для карбонильных, соединений, эпоксидов, эфиров и сложных эфиров, поскольку они не могут образовывать водородных связей с сорбентом.

Приготовление. Оксид алюминия, как и силикагель, очищают от примесей железа, для чего кипятят с концентрированной соляной кислотой, затем отмывают дистиллированной водой до полного отсутствия ионов хлора, сушат в течение 48 ч при 300-400 0С. После этого добавляют определенное количество воды до нужной активности.

Флорисил - это основной силикат магния (Мg3[Si4О10](ОH)2), чья полярность находится между силикагелем и оксидом алюминия. Используется для хроматографирования сахаров, эфиров, спиртов, гликолей и гликозидов

17

(при рН = 8 - 10).

Кизельгур - это сильнопористый сорбент, представляющий собой микроскопические зерна опалового кремнезема (двуокиси кремния). Как сорбент он слабее силикагеля и окиси алюминия и употребляется для хроматографии кетокислот, оксикислот, лактонов и других сильно гидрофильных органических соединений. Иногда кизельгур используют в смеси с силикагелем или гипсом, который должен быть химически чистым.

1.9. Органические полярные сорбенты Полиамиды - это сорбенты, которые обладают как адсорбционными,

так и распределительными хроматогpафическими свойствами. Карбоксамидная группа (-СОNН2 -) в таких сорбентах является адсорбционно-активной. Поэтому такие фазы могут быть использованы для разделения фенолов (пищевых красителей, флавонов, таннинов и др.), нитрофенолов, спиртов и кислот. Расстояние между пептидными связями обеспечивается липофильными цепями, состоящими из СН2 -групп, которые, естественно, вносят вклад в распределительные хроматографические свойства. Они могут вступать в гидрофобные взаимодействия.

Целлюлоза - органический полимер природного происхождения. В качестве сорбента применяются порошки целлюлозы, содержащие и не содержащие гипс. Целлюлоза используется для разделения смесей биологически важных компонентов, например при гидролизе белка.

Ионообменные смолы (ионообменники) начали применяться в хроматографии недавно. Для этой цели пользуются диэтиламиноэтилцеллюлозой

(ДЭАЭ) - MN 300 DЕАЕ и MN 300 G/DEAE и целлюлозой MN 300 ECTEOLA и MN 300 G/ECTEOLA, которые являются коммерчески доступными.

Сефадексы - молекулярные сита, представляют собой сшитые декстрины (гидрофильные полисахаридные цепи, поперечно связанные друг с другом и образующие устойчивую трехмерную макромолекулярную структуру).

Сефадекс практически не имеет ионных групп, его полярность объясняется содержанием в нем большого количества гидроксильных групп.

1.10. Органические фазы средней полярности и органические неполярные фазы

Органические фазы средней полярности

По уменьшению полярности сорбентов их можно расположить в ряд: немодифицированный силикагель > модифицированный силикагель с амино- > циано- > диол- > RP-2 > RP-8 > RР-18-группами (диметил- (RP2), этил-, октил- (RP8) или октадециловые (RP18) группы, Р - амино-, циано- и диолгруппы).

Для расширения селективности между полярными силикагельными слоями и неполярными RР-фазами были разработаны амино-, циано- и диольные фазы, в которых функциональная конечная группа и атом кремния разделены «прокладкой» из трех групп СН2. Эти фазы могут использоваться как в нор-

18

мально-фазовой, так и в обращенно-фазовой хроматографии (когда подвижная и стационарная фаза находятся в разном агрегатном состоянии).

Сорбенты с аминофазами - фазы имеют пропиламиновые радикалы, ковалентно связанные с силикагелем. Слой обладает основными свойствами, что делает его пригодным для хроматографирования компонентов с такими же свойствами (аминов, алкалоидов). Для подавления диссоциации не нужно добавлять основания к подвижной фазе. Адсорбционное разделение незаряженных молекул в соответствии с различием полярностей возможно на этих фазах при использовании безводных подвижных фаз. Адсорбция веществ осуществляется за счет взаимодействия с силанольными группами и конечными аминогруппами сорбента.

Сорбенты с цианофазами - для этих сорбентов характерны цианопропильные группы, связанные со стандартизованным силикагелем. Слои имеют нейтральную реакцию по отношению к водным элюентам.

Сорбенты с диольными фазами - силанольные группы этих фаз связаны с радикалами 1,2-пропандиола через пропильные пространственные группы («прокладки»). Хроматографические свойства покрытий определяются алкильными радикалами и спиртовыми группами.

Органические неполярные фазы Гидрофобномодифицированные (обращенно-фазовые) сорбенты.

Обращенно-фазовые слои получают в результате химической прививки алкилсиланов к силикэгельному скелету. В качестве алкильных заместителей используют диметил- (RP2), этил-, октил- (RP8) или октадециловые (RP18) группы.

Такая прививка уменьшает количество реакционноспособных силанольных групп и приводит к образованию новых силоксановых групп, обладающих меньшей химической активностью.

RP неподвижные фазы используют для разделения в распределительной хроматографии (с гидрофильными подвижными фазами). Компоненты пробы в этом случае удерживаются за счет гидрофобных взаимодействий.

1.11. Теория хроматографического разделения

Согласно теории Синджа и Мартина в методе теоретических тарелок колонку мысленно можно разделить на участки - тарелки. На каждой тарелке быстро устанавливается равновесие между подвижной фазой и сорбентом. Новая порция элюента приводит к смещению этого равновесия, а часть вещества переносится на следующую тарелку, где также устанавливается равновесие. В ходе этих процессов хроматографируемое вещество распределяется на нескольких тарелках причем на средних тарелках концентрация его максимальна. Эффективность колонки тем выше чем меньше высота эквивалентная теоретической тарелке (Н), и больше число теоретических тарелок (N).

Кинетическая теория хроматографии рассматривает кинетику процесса, связывая высоту, эквивалентную теоретической тарелке, с процессами диффузии, медленным установлением равновесия и неравномерностью процесса.

19

Высота, эквивалентная теоретической тарелке связана со скоростью потока уравнением Ван-Деемтера:

H A UB CU .

Константа А связана с действием диффузии, которая зависит от размера частиц и плотности заполнения колонки, В связана с коэффициентом диффузии молекул в подвижной фазе, С характеризует кинетику процесса сорбциядесорбция. Данная теория дает основу для оптимизации хроматографического процесса.

1.12. Классификация хроматографических методов

Хроматографические методы классифицируют по общим признакам: по агрегатному состоянию среды разделяемой смеси компонентов; по механизму (или химизму) процесса разделения; по форме (технике) проведения хроматографического процесса.

1.По агрегатному состоянию смеси, в котором проводят ее разделение на компоненты - газовая, жидкостная и газожидкостная хроматография.

2.По механизму разделения - адсорбционная, распределительная, ионообменная, осадочная, окислительно-восстановительная, адсорбционнокомплексообразовательная хроматография. .

3.По форме проведения хроматографического процесса - колоноч-

ная, капиллярная, плоскостная (бумажная, тонкослойная и мембранная). Разделение веществ может происходить и в результате нескольких од-

новременно действующих механизмов. Это приводит к образованию хроматограмм смешанного типа, однако, один из процессов всегда является доминирующим.

4.По агрегатному состоянию среды, в которой осуществляется разде-

ление, различают газовую, жидкостную и газожидкостную хроматографию.

5.По механизму процесса разделения смесей выделяют адсорбцион-

ную, ионообменную, осадочную распределительную, окислительновосстановительную и адсорбционно-комплексообразовательную хроматографию.

Описание отдельных разновидностей хроматографии

1.Адсорбционно-жидкостная хроматография - разделение жидких веществ вследствие различной адсорбируемости их на сорбенте. Вещества по силе сорбируемости на данном сорбенте образуют адсорбционный ряд: А> В > С. Каждый из членов адсорбционного ряда, обладая большим адсорбционным сродством, чем последующий, вытесняет его из соединения и в свою очередь вытесняется предыдущим. Таким образом, можно разделить молекулы неэлектролитов.

2.Газоадсорбционная хроматография - разделение смеси газов на твердом сорбенте. В качестве сорбента (неподвижной фазы) используют активное дисперсное твердое вещество: активный уголь, силикагель, цеолиты и др. В качестве подвижной фазы, в которой содержится разделяемая смесь га-

20