Физиология и биохимия микроорганизмов. Учебное пособие для студентов специальности 06.01.03 – «Биология» высших учебных заведений
.pdfМаслянокислые бактерии содержат в своих клетках гранулезу, которая окрашивается раствором Люголя в синий цвет.
С культуральной жидкостью проводят качественную реакцию на масляную кислоту. Для этого к 5 мл жидкости добавляют 2 мл 5 %-ного хлорида железа (Ш). При нагревании образуется маслянокислое железо коричневого цвета.
71
Лабораторная работа №5: «Молочнокислое брожение»
Молочнокислое брожение представляет собой анаэробный процесс разложения углеводов ферментами молочнокислых бактерий с образованием молочной кислоты и других продуктов. В зависимости от вида бактерий,
производящих этот процесс, конечные продукты брожения могут быть разными. Различают гомоферментативное молочнокислое брожение, при котором молочный сахар образует только молочную кислоту.
При гетероферментативном брожении, кроме молочной кислоты,
образуются другие продукты (летучие кислоты, спирты, газы, эфиры).
Возбудителями гомоферментативного брожения являются микроорганизмы: Streptococcus laktis – имеют вид овальных кокков диаметром
0,5-1,0 мкм, располагаются в культуре попарно (диплококки) или короткими цепочками (стрептококки), реже одиночными клетками; Streptoccocus cremoris
– клетки расположены более длинными цепочками; Lactobacillus bulgaricus –
крупная палочка (длиной 4-5 мкм), неподвижная, грамположительная,
располагается в виде отдельных клеток и коротких цепочек, оптимальная температура ее развития 40-45 ; Lactobacillus acidophilus – по морфологии близка к болгарской, но имеет другой температурный оптимум развития – 37 .
Используется для изготовления ацидофилина.
Микроорганизмы гетероферментативного брожения чаще встречаются в заквашенных овощах и силосе. К ним относятся Lactobacillus brevis,
Lactobacillus brassicae, Leuconostos mesenteroides и др.
В промышленности используются культурные расы бактерий, которые имеют ряд преимуществ перед дикими формами.
Материалы и оборудование: молочнокислые продукты, огуречный и капустный рассол, микробиологические петли, спиртовки, раствор метиленового синего, пинцеты, микроскопы, пробирки, спиртовки, смесь Никифорова, пробирки стерильным молоком, чистые культуры молочнокислых бактерий, воронки со складчатыми фильтрами, 10%-ный раствор серной
72
кислоты, 2%-ный раствор перманганата калия, 0,5%-ный раствор нитрата серебра, полоски фильтровальной бумаги, концентрированная серная кислота,
насыщенный раствор медного купороса, 0,2%-ный спиртовой раствор тиофена,
водяная баня, электрическая плитка.
Ход работы
Для ознакомления с бактериями молочнокислого брожения можно воспользоваться готовыми молочнокислыми продуктами (простокваша,
ацидофилин, кефир) и рассолом квашеной капусты и огурцов.
Указанные продукты наносят петлей на предметное стекло и делают тонкий мазок. Мазок фиксируют и одновременно обезжиривают смесью Никифорова (10 мин).
Окрашивают в течение 3-5 мин водным раствором метиленового синего,
промывают водой, высушивают и микроскопируют с объективом МИ-90.
Для доказательства образования молочной кислоты проводят качественную реакцию. Один из молочнокислых продуктов фильтруют через складчатый фильтр. В пробирку к 2 мл фильтрата добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты и 10 капель насыщенного раствора медного купороса. Нагревают при потряхивании на водяной бане при 100 в
течение 5 мин. После охлаждения добавляют 3-5 капель 0,2%-ного раствора тиофена в спирту. В присутствии молочной кислоты возникает вишнево-
красное окрашивание.
73
Лабораторная работа №6: «Выделение уксуснокислых бактерий»
Уксуснокислые бактерии широко распространены в природе. Она встречаются на фруктах и овощах, в алкогольных напитках. Уксуснокислые бактерии ведут процесс окисления этилового спирта в уксусный альдегид и далее в уксусную кислоту.
Уксуснокислые бактерии объединены в род Acetobacter, типовой вид
Acetobacter aceti представлен слабо подвижными палочковидными эллиптическими клетками 0,6-0,8 х 1,0-3,0 мкм, одиночными, в парах или цепочках. Нередко образует инволюционные формы в виде раздутых,
разветвленных или нитевидных образований. Уксуснокислые бактерии легко выделяются из пива.
Материалы и оборудование: конические колбы объемом 100-150 мл,
пиво, предметные стекла, микробиологические петли, раствор метиленового синего, микроскопы, пинцеты, 10%-ный раствор соды, хлорида железа (Ш).
Ход работы
В конические колбы наливают тонкий слой пива (0,5-1,0см). Толщина слоя пива имеет большое значение для исхода опыта, так как для уксуснокислых бактерий должны быть созданы аэробные условия. Колбы закрывают ватными пробками и ставят в термостат при температуре 30 на 5-7
суток.
На следующем занятии колбы просматривают, описывают характер образовавшихся пленок, микроскопируют окрашенные мазки, делают качественную реакцию на уксусную кислоту. Для этого жидкость нейтрализуют 10%-ным раствором соды и добавляют немного раствора хлорида железа (Ш) (произвольной концентрации). Смесь нагревают. При наличии уксусной кислоты появляется красное окрашивание вследствие образования ацетата железа (Ш).
74
Лабораторная работа №7: «Отношение к источникам углерода и
азота»
Чтобы установить доступные источники углерода, готовят основную синтетическую среду, содержащую, г на 1 л дистиллированной воды:
(NH4)2HP04 - 3,0; КН2Р04 - 2,0; NaCl- 0,5; MgS04-7H20 - 0,3; CaCl2-6H20 - 0,1;
FeCl3x6H20 - 0,01. Кроме того, в среду входит смесь микроэлементов по М.В.
Федорову - 1 мл, которая содержит, г на 1 л дистиллированной воды: Н3В03 - 5; (NH4)2Mo04 - 5; KCI- 0,5; NaBr- 0,52; ZnS04-6H20- 0,2; Al2(S04)3- 0,3.
К готовой минеральной среде добавляют 1% источника углерода. Обычно испытуемые пентозы (арабиноза, ксилоза), гексозы (глюкоза, левулеза,
галактоза) стерилизуют при 100°С в кипятильнике Коха; дисахариды (сахароза,
мальтоза, лактоза), полисахариды (декстрин, крахмал, клетчатка), соли органических кислот (муравьиная, уксусная, масляная, янтарная,
щавелевоуксусная, яблочная, винная, лимонная, пировиноградная, глюконовая,
салициловая, бензойная, протокатеховая), спирты (этиловый, глицерин,
эритрит, маннит, дульцит), жиры и углеводы стерилизуют 30 мин в автоклавах при 1 атм.
При испытании источников азота в основной минеральной среде фосфат аммония заменяют двухзамещенным фосфатом калия (К2НР04) и к среде добавляют 1 % глюкозы или другого доступного углевода. В качестве источника азота обычно используют альбумин, пептон, а также аспарагин,
глицин и другие аминокислоты, мочевину, аммиачные соли, соли азотистой и азотной кислоты в количестве 0,1 - 0,2 % объема питательной жидкости. Для выявления способности микроорганизмов усваивать молекулярный азот из питательной среды исключают все связанные формы азота.
Изучение продуктов жизнедеятельности
При использовании микроорганизмами источников углерода, в частности углеводов, продуктами их жизнедеятельности нередко бывают газы, кислоты и
75
спирты. Для обнаружения газов применяют посев уколом в агаровую среду в пробирки. При появлении газов столбик агар-агара разрывается.
Используют также жидкую среду с перевернутыми вверх дном поплавками. Поплавок представляет собой небольшую узкую пробирку (0,5хЗ. 4 см). Его опускают вверх дном в обычную пробирку с жидкой средой, которая при стерилизации заполняет поплавок.
При развитии микроорганизмов, образующих газы, последние вытесняют жидкость из поплавка.
Образование кислот при посеве на средах, содержащих углеводы,
устанавливают при помощи индикатора бромтимолблау, а их количество - по титрованию 0,1н. раствором щелочи.
При наличии мела кислоты связываются в кальциевые соли, которые можно обнаружить добавлением к 5 мл среды.1 мл концентрированного раствора оксалата аммония.
В присутствии кислот (например, уксусной) выпадает белый осадок, не растворимый в воде. Образование спирта определяют при отгоне части субстрата с последующей пробой на спирт (реакция на появление йодоформа).
Продуктами жизнедеятельности микроорганизмов на доступных источниках азота часто бывают: аммиак (проба с реактивом Несслера), сероводород и меркаптан (проба с фильтровальной бумагой, смоченной ацетатом свинца),
индол (проба с азотистой кислотой), нитрит (проба с цинк-йод-крахмалом в кислой среде).
Редуктазную способность культур выявляют обесцвечиванием метиленового синего.
Отношение к кислороду
Об отношении микроорганизмов к кислороду судят по росту культуры при посеве уколом в пробирку с агаровой или желатиновой средой. Аэробы развиваются в верхней части укола - рост в виде гвоздя; факультативные анаэробы - равномерно по всему уколу; анаэробы - в нижней его части.
76
Тесты для самоконтроля:
1. Необходимые для жизнедеятельности вещества клетка получает
-: от другой клетки
-: из внешней среды
-: из внутренней среды
-: нет верного ответа
2. Продукты метаболизма клетка выводит
-: в другую клетку
-: во внешнюю среду
-: во внутреннюю среду
-: нет верного ответа
3. Ассимиляция – это
-: энергетический обмен
-: обмен зарядами
-: пластический обмен
-: не обменный процесс
4. Диссимиляция – это
-: энергетический обмен
-: обмен зарядами
-: пластический обмен
-: не обменный процесс
77
5. Ассимиляция протекает
-: с поглощением кислорода
-: с выделением кислорода
-: с выделением энергии
-: с поглощением энергии
6. Диссимиляция протекает
-: с поглощением кислорода
-: с выделением кислорода
-: с выделением энергии
-: с поглощением энергии
7. Метаболизм – это
-: одна из стадий развития организма
-: совокупность процессов ассимиляции и диссимиляции
-: постоянство внутреннего состава клетки
-: тип взаимоотношений организмов
8. Какой тип биологического окисления характерен для бактерий
-: прямое окисление
-: непрямое окисление
-: непрямое неполное окисление
-: все ответы верны
9. Какой тип метаболизма имеет место при полном окислении
-: бродильный
-: окислительный
78
-: окислительно-бродильный
-: никакой
10.Какие из перечисленных бактерий обладают окислительно-
бродильным типом метаболизма
-: анаэробы
-: аэробы
-: строгие анаэробы
-: факультативные анаэробы
11. Фототрофы используют
-: энергию света
-: энергию воды
-: энергию ветра
-: энергию воздуха
12. Хемотрофы используют энергию
-: химических источников
-: физических источников
-: ветра
-: света
13. Активный транспорт протекает без затрат:
-: энергии
-: воды
-: света
-: времени
79
14. Облегченная диффузия-это перемещение веществ от :
-: низкой к более высокой концентрации
-: более высокой концентрации к более низкой
-: максимальной к минимальной концентрации
-: никакой
15. Изомеразы – это
-: фосфогексоизомеразы
-: эстеразы
-: нуклеазы
-: дегидрогеназы
16. Оксиредуктазы – это ферменты
-: окислительные
-: восстановительные
-: окислительно-восстановительные
-: никакие
17. Гидролазы ускоряют реакции:
-: плазмолиза
-: гидролиза
-: дегидрогенирования
-: никакие
18. Трансферазы – это
-: оксидазы
-: глютаминсинтетазы
80