Физиология и биохимия микроорганизмов. Учебное пособие для студентов специальности 06.01.03 – «Биология» высших учебных заведений
.pdfОбразование кислот и щелочей в культуре можно выявить, добавляя к среде индикатор или краситель, например, бромкрезоловый фиолетовый,
который в присутствии кислоты становится желтым. Цвет фенола красного меняется в щелочной среде из желтого в красный.
Изменение цвета индикатора служит доказательством брожения или использования субстрата. Однако некоторые микроорганизмы способны использовать и кислоты.
Добавление свежей сыворотки к среде также искажает результаты,
потому что сыворотка часто содержит посторонние гидролитические ферменты животного происхождения, является мощным буфером.
Контролировать культуру следует каждые 24 часа для того, чтобы не пропустить время появления кислоты.
Обычно в процессе бактериального брожения выделяются различные количества углекислоты и водорода. Относительное содержание углекислоты и водорода можно установить, отмечая сперва уровень газа в перевернутой вверх дном пробирке и добавлением затем в нее концентрированный раствор NaOH.
В результате поглощения щелочью углекислого газа отмечается только присутствие водорода. Различия в уровнях жидкости легко определить.
Сероводород. Многие микроорганизмы способны в процессе метаболизма использовать серосодержащие органические соединения, при этом выделяется значительное количество сероводорода. При процессах гниения обычно ощущается запах сероводорода. Некоторые микроорганизмы можно отличать от других по их способности образовывать сероводород.
Например, Salmonella paratyphi B (один из возбудителей паратифа)
образует сероводород, тогда как близкородственный вид Salmonella paratyphi А
этого газа не образует. Таким образом, тест на образование сероводорода имеет диагностическое значение.
Существует два метода обнаружения H2S – применение полоски бумаги,
пропитанной уксуснокислым свинцом и метод укола. При первом методе,
61
выделяющийся сероводород вызывает почернение уксуснокислого свинца на полоске бумаги, подвешенной над средой, при втором – сероводород вызывает почернение уксуснокислого свинца, заранее внесенного в агаровую среду.
Определение протеолитической активности микроорганизмов Желатина. Если микроорганизм вызывает гидролиз желатины, то этот
микроб может вызывать гидролиз всех белков. Желатина широко применяется,
чтобы определить разжижение желатины. Самый распространенный метод выявления этой активности проводят следующим образом.
Добавляют в питательный агар желатину, стерилизуют, пробирки засевают большим количеством молодой культуры, инкубируют 1-5 часов.
Внесение в пробирки коагулянтов позволяет выявить светлые зоны разжижения.
Сыворотка. Среды со свернутой сывороткой готовят из лошадиной или бычьей сыворотки (3 части) и питательного бульона (1 часть). Пробирки устанавливают в наклонном положении; при осторожном нагревании сыворотка свертывается и одновременно стерилизуется. После охлаждения среды скошенную поверхность засевают, размазывая по ней каплю культуры.
Если микроорганизм вызывает гидролиз сыворотки, то она становится коричневатой и полупрозрачной, рост микроба происходит в углублении.
Иногда при температуре 370С сыворотка полностью разжижается за 48 часов,
что особенно часто наблюдается при культивировании плесеней и спорообразующих аэробных бацилл.
Способность микроорганизмов переваривать сыворотку можно выявить также путем добавления сыворотки к питательному агару в пробирках и такой же последующей обработки засеянной среды, как и при выявлении гидролиза желатины.
Действие на молоко. Свежее молоко имеет рН 6,8 и является идеальной культуральной средой для многих микроорганизмов. Для использования в
62
качестве культуральной среды снятое молоко разливают по пробиркам из расчета приблизительно 5 мл в каждую. Стерилизация 10 минут при 1200С
уничтожает микроорганизмы.
Дальнейшее добавление индикатора, в частности, бромкрезолового фиолетового, позволяет выявить сбраживание лактозы. Об образовании сычужного фермента можно судить по свертыванию молока.
Часто после свёртывания молока наступает гидролиз казеина. Молоко становится коричневатым и полупрозрачным, а сгусток растворяется.
Чашечные методы. Хороший метод для определения способности многих микроорганизмов вызывать гидролиз испытуемых веществ, например,
сахаров, желатины, жиров, крахмала, заключается в добавлении испытуемого вещества к агару, налитому в чашки Петри.
Поверхность застывшего агара обильно засевают. После появления интенсивного роста поверхность агара заливают реактивом, который реагируя с испытуемым веществом, дает видимую характерную реакцию. Если микроб образует гидролитические ферменты, то зоны роста или зоны, окружающие рост микроба, будут давать другую реакцию или реакции вообще не будет.
Например, чашки с крахмалом можно обработать раствором Люголя.
Вокруг колоний, вызывающих гидролиз крахмала, появляются бесцветные зоны. Остальная часть приобретает темно-синюю окраску.
Способность сбраживать тот или иной углевод можно определить,
добавляя к питательному агару индикаторы, например, фенол красный (желтый при кислой реакции, красный при щелочной реакции среды).
После инкубации вокруг колоний, образующих кислоту, определяются желтые зоны. Образование газа при этом не происходит.
Расщепление жиров (липолиз). Многие микробы образуют ферменты,
которые гидролизуют один или несколько видов жиров или липидов.
Один из методов следующий: пластинку питательного агара засевают полосками испытуемого микроба.
63
Затем масло или растопленный жир разбрызгивают тонким слоем по поверхности агаровой пластинки. После инкубации капельки жира исследуют под микроскопом при малом увеличении. Капельки гидролизованного жира отличаются от других тем, что утратили свою прозрачность.
64
Практическая часть
Лабораторная работа № 1: «Определение внеклеточных ферментов»
Способность микроорганизмов усваивать различные высокомолекулярные соединения, такие как протеины, углеводы, жиры и т.д., в
качестве питательных веществ, однако не означает, что все эти компоненты, в
состоянии проникнуть через клеточную мембрану.
Большинство этих соединений разлагается еще до проникновения в клетку, ферментами внешней секреции, выделяемыми бактериями. Эти экзоферменты относятся к гидролазам.
Только разложившись до продуктов, находящихся в растворенном виде, в
стадии мономеров или димеров, способны проникнуть внутрь клетки. Для этого существуют различные транспортные механизмы поступления питательных веществ в клетку: пассивный транспорт, активный и т.д.
Большинство микроорганизмов способно к выработке экзоферментов,
причем эту способность можно выявлять различными методами в микробиологической практике. Культивирование микроорганизмов на питательных средах с добавлением агара и высокомолекулярных субстратов,
дает зоны растворения этих веществ вокруг выросших колоний бактерий,
вырабатывающих экзоферменты.
Амилолитическая активность (гидролиз крахмала)
Некоторые виды бацилл, стрептомицеты, псевдомонады, мицелиальные грибы вырабатывают фермент амилазу. Амилазы обладают способностью к гидролизу крахмала.
Для выявления амилолитической активности часто используют среду следующего состава (г/л): пептон10,0; KH2PO4 – 5,0; растворимый крахмал –
2,0; агар – 15,0; рH среды 6,8 – 7,0.
После стерилизации при 1,0 атм питательной среды в автоклаве разливают ее в стерильные чашки Петри. Дают застыть среде, затем проводят засев исследуемой культуры уколом или штрихом.
65
Помещают в термостат на инкубацию сроком от 2 до 10 дней. Для определения амилолитической активности нужно обработать раствором Люголя агаровую пластинку, налив 3-5 мл соответствующего раствора.
Взаимодействие йода с крахмалом дает синее окрашивание,
соответственно, среда посинеет, а зоны расщепления крахмала обесцветятся.
Если произошло расщепление крахмала до декстринов, окраска станет красно-
бурой. Следовательно, размеры светлых зон свидетельствуют о величине амилолитической активности.
Лабораторная работа № 2: «Определение протеолитической
активности»
Расщепление протеинов на олиго- и полипептиды происходит под влиянием протеолитических ферментов, называемых протеазами. Большинство различных микроорганизмов, в том числе актиномицеты,бациллы и т.д.
вырабатывают протеазы.
Для определения протеолитической активности используют питательные среды с добавлением желатины, казеина и некоторых других белков.
Для выявления этой способности исследуемый микроорганизм высевают на мясопептонную желатину (МПЖ), приготовленную следующим образом: к
МПБ добавляют 10 – 15% желатины и оставляют на 2030 минут, чтобы желатина набухла, затем смесь нагревают на водяной бане до полного растворения желатины и разливают в пробирки по 8 -10 мл. Стерилизуют при
0,5 атм 15 мин. Посев осуществляют уколом. Культивируют 7-10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатины или его отсутствие отмечают визуально. Если желатина разжижается, указывают интенсивность и форму разжижения. Разжижение бывает послойным, воронкообразным,
пузыревидным, мешковидным, кратеровидным и т.д. (рис.2)
66
Рис. 2. Схема разжижения желатины микроорганизмами при посеве уколом.
Протеолиз казеина.
Для выявления этой способности используют молочный агар – среду,
состоящую из равных частей стерильного обезжиренного молока и стерильного
3% -го водного агара. Как правило, перед приготовлением среды молоко обезжиривают центрифугированием в течение 15 минут при 650 -1500g. Жиры,
которые образуют на поверхности молока достаточно плотную плёнку,
удаляют, а молоко стерилизуют при 0,5 атм. После стерилизации его подогревают и добавляют при постоянном помешивании к стерильному расплавленному и остуженному до 50 водному агару. Полученную среду разливают в стерильные чашки Петри. Микроорганизмы высевают штрихом по диаметру чашки или уколом. Культивируют 2 -10 сут. Гидролиз казеина обнаруживают по зоне просветления среды вокруг колоний или выросших по штриху микроорганизмов. Особенно чётко она видна после обработки среды
5% -м раствором трихлоруксусной кислоты. Зону гидролиза казеина измеряют в миллиметрах от края штриха или колонии до границы светлой зоны. Чем выше диаметр светлой зоны, тем выше казеинолитическая активность бактерий.
67
Лабораторная работа №3: «Спиртовое брожение»
Микроорганизмов, способных вызывать спиртовое брожение, довольно много: плесневые и дрожжевые грибы, определенные виды бактерий.
Существуют как дикие, так и культурные расы дрожжей, причем культурные получены в результате селекции из диких. Их основное отличие по свойствам образования меньшего количества побочных продуктов и выдерживания высоких концентраций спирта в питательной среде привело их активному использованию в производстве.
Интенсивность процессов брожения с отличными конечными результатами характеризует вид Saccharomices cerevisiae.
Материалы и оборудование: колбы на 250 мл, сахароза, пекарские дрожжи, мерные цилиндры, пробки и изогнутые трубки, водяные бани,
электрические плитки, баритовая вода, пробирки, спиртовка с прямыми стеклянными трубками, KCrO.
Ход работы В колбу емкостью 250 мл наливают 50 мл 20%-ного раствора сахарозы и
около 1г пекарских дрожжей, разведенных в 10 мл раствора сахарозы (20%). (Дрожжи следует развести за час до занятий и поставить в теплое место, чтобы повысить их активность.)
Колбу закрывают пробкой с изогнутой стеклянной трубкой. Нижний конец трубки погружают в пробирку с баритом. Колбу с бродящей жидкостью помещают на водяную баню, в которой периодическим подогреванием поддерживают температуру около 35-40C.
Через несколько минут после установки прибора в пробирку с баритом начинают поступать пузырьки газа. Вначале они выделяются неравномерно,
толчками, так как из колбы выходит нагретый воздух. Через некоторое время
(10-15 мин) пузырьки начинают выходить равномерной цепочкой.
Можно считать, что к этому времени весь воздух из колбы вытеснен и через трубку выходит один из продуктов брожения – углекислый газ.
68
Баритовая вода интенсивно мутнеет вследствие образования осадка
BaCO. Доказать образование спирта на том же занятии не удается, так как его накапливается за это время недостаточно.
Колбы с бродящей жидкостью закрывают ватными пробками и оставляют до следующего занятия в комнате. На следующем занятии в жидкости обнаруживают спирт.
В пробирку к 2-3 мл исследуемой жидкости добавляют кристаллик бихромата калия и несколько капель концентрированной серной кислоты,
нагревают смесь на спиртовке. Цвет жидкости при этом изменится до зеленного вследствие окисления хрома. Выделяющийся уксусный альдегид ощутим по запаху.
Обнаружение спирта отгонкой Колбу с бродильной жидкостью закрывают пробкой, в которую вставлена
идущая вверх прямая стеклянная трубка длиной 40-50см. Колбу нагревают до равномерного кипения жидкости и к концу стеклянной трубки подносят горящую лучинку. Выделяющиеся пары спирта воспламеняются, над трубкой возникает эффективный факел, наблюдаемый в течение нескольких секунд.
Кипение не должно быть слишком бурным, иначе жидкость будет выплескиваться через трубку и гасить факел.
69
Лабораторная работа №4: «Маслянокислое брожение»
Маслянокислое брожение – сложный процесс превращения углеводов в масляную кислоту и другие продукты, совершаемый группой анаэробных спороносных бактерий.
Процессу маслянокислого брожения подвергаются не только сахара, но и другие, более сложнее углеводы. Маслянокислые бактерии имеют различные активные ферменты, способные производить расщепление сложных углеводов.
Образующаяся масляная кислота в невысоких концентрациях является веществом, стимулирующим рост высших растений.
Материалы и оборудование: большие пробирки, резиновые пробки к ним, клубни картофеля, пинцеты, скальпели, мел в порошке, водяная баня,
раствор Люголя, 5%-ный раствор хлорида железа (Ш).
Ход работы Неочищенный картофель нарезают ломтиками, которые могут легко
войти в пробирку. Заполняют ими пробирку на 1/3 объема, добавляют щепотку мела и заполняют водой почти доверху. Пробирки ставят на водяную баню при температуре 80 на 10-15 мин. Затем пробирки закрывают пробками и переносят в термостат с температурой 25 . В этих условиях уже через 2-3 дня в жидкости обнаруживают бактерии маслянокислого брожения.
Культура маслянокислых бактерий при этом является элективной. Для них преимущественного развития созданы анаэробные условия, бесспоровые формы убиты предварительным нагреванием, добавка мела нейтрализует образующиеся кислоты и способствует развитию бактерий.
На следующем занятии жидкость микроскопируют и обнаруживают главным образом Cl. pasteurianum – подвижные палочки с закругленными концами, одиночные и парные. В старых культурах у одного из концов клетки обнаруживают спору. При микроскопировании можно рекомендовать добавление к капле культуральной жидкости капли раствора Люголя.
70