Физиология и биохимия микроорганизмов. Учебное пособие для студентов специальности 06.01.03 – «Биология» высших учебных заведений

митохондрии – промитохондрии, в которых нет крист, электронно-

транспортной цепи и нет окислительного фосфорилирования.

При появлении кислорода структурная и функциональная целостность митохондрии восстанавливается и это говорит о том, что нормальный метаболизм дрожжей связан с аэробным дыханием.

Главная роль в метаболизме принадлежит окислительно-

восстановительным реакциям. Типы реакций зависят от окружающих условий.

В анаэробных условиях происходят брожения, метаногенез и анаэробное дыхание. В природе все типы метаболизма тесно связаны.

Полное разложение органического вещества строго в анаэробных условиях может завершится метаногенезом или образованием восстановленных соединений серы или азота.

В аэробных условиях роль конечного акцептора выполняет молекулярный кислород, который восстанавливается до воды. Большая часть микробов, включая бактерии, осуществляют аэробный тип дыхания.

Вопросы к теме:

1.Как вы понимаете процесс дыхания для микроорганизмов?

2.Есть ли у микроорганизмов специальные органы для дыхания?

3.Какие виды дыхания существуют?

4.Как вы понимаете анаэробное дыхание?

5.Как создаются безкислородные условия?

6.Каково значение анаэробного дыхания?

11

Бродильный тип метаболизма

Брожение зависит от способности органических соединений служить акцепторами электронов. Поэтому восстановленные акцепторы выступают конечными продуктами процесса. Это наиболее древний способ существования у бактерий. Для брожений типично: участие не связанных с мембранными структурами ферментов, неполное окисление исходного субстрата, образование недоокисленных конечных продуктов.

АТФ в брожении у большей части облигатных анаэробов образуется в процессе субстратного фосфорилирования, который состоит в присоединении фосфора к веществу, окисляемому в энзиматической реакции с последующим образованием энергетически богатой фосфатной связи в окисленном продукте.

Чтобы быть сброженным, вещество должно быть не очень окисленным и не слишком восстановленным. Этому требованию соответствуют углеводы,

хотя некоторые бактерии сбраживают огромное количество различных веществ от аминокислот до органических кислот, а также пиримидиновые и пуриновые основания.

Углеводы хорошо утилизируются, могут обеспечить скелеты для синтеза аминокислот, удобны для сохранения энергии: образуемые из них нерастворимые полимеры – крахмал и гликоген – могут аккумулироваться, не оказывая влияние на осмотическое давление клетки.

Подготовительный этап – гликолиз. Брожениям предшествует расщепление гексоз по гликолитическому пути, осуществляющийся и в присутствии кислорода, а также и в его отсутствии.

Гликолиз слагается из девяти последовательных ферментативных реакций, в результате которых образуются 2 молекулы ПВК из глюкозы.

В результате гликолиза образуется две молекулы АТФ. Только молочнокислые бактерии используют всю энергию в процессе гликолиза. Для других организмов гликолиз – это подготовительный этап к дыханию или к брожению, дающих большой дополнительный выход энергии нужных клетке

12

строительных материалов, поэтому гликолиз относят к амфиболическим путям.

Водород, отнятый при дегидрогенизации глицеральдегид-3-фосфата,

переносится на дегидрогеназы, коферментом которых служит НАД. В клетках существует ограниченное количество молекул НАД, то должна постоянно происходить его регенерация из НАДН: НАД=НАДН.

У аэробных микроорганизмов, осуществляющих аэробное дыхание,

НАДН через переносчики дыхательной цепи передает водород на молекулярный кислород с образованием воды так, что проблемы с регенерацией НАДН у них нет.

У фототрофных бактерий водород, фиксированный в НАДН2, в

дальнейшем используется для восстановления СО2, иногда и N2 до уровня углеводов.

Проблема есть у анаэробов, которые могут синтезировать специальные молекулы – акцепторы водорода для регенерации НАД. Поэтому в разных брожениях, которые продолжают гликолиз, только 1-2 реакции служат для получения энергии, а все остальные реакции имеют связь с акцепторами Н2,

реакции катаболизма сливаются с реакциями, которые не относятся к реакциям синтеза АТФ.

Типы брожений.

1. Во многих случаях акцепторы электронов образуются из субстрата в неразветвленных путях. К таким типам брожений относится спиртовое,

гомоферментативное молочнокислое, в которых реакции дегидрогенирования и гидрогенирования сопряжены НАД/НАДН-циклом.

2. Особый тип этих реакций представляет маслянокислое брожение,

которое осуществляют сахаролитические клостридии. У них окисление пировиноградной кислоты до ацетил-СоА и СО2 сопряжено с восстановлением ферредоксина, который далее восстанавливает протоны до молекулярного водорода.

13

3. У пептолитических клостридий другой вариант реакций - реакции Стикланда, в которых используется внешний акцептор электронов. Например,

аланин окисляется через пировиноградную кислоту до ацетата, СО2 и аммония,

авторая аминокислота – глицин – восстанавливается, давая ацетат и аммоний.

4.Брожение, в котором место имеет комбинация этих реакций: электроны могут частично переноситься между внутриклеточными метаболитами, а

частично к электронному акцептору, который может использовать данная клетка. Клостридии сбраживают этанол и ацетат с образованием бутирата, капроата и Н2.

5.Возможным вариантом электронного потока рассматривают их перенос

на протоны, при этом образуется Н2.

Очень немногие субстраты имеют достаточно отрицательный электрохимический потенциал, чтобы переносить электроны на протоны,

поэтому выделение Н2 во многих случаях происходит очень слабо. Но образованию Н2 может благоприятствовать низкое парциальное давление водорода в культуре.

Если организм выделяет водород, то для него выгоден симбиоз с другим организмом, который активно потребляет водород в экзергонической реакции.

Много таких межвидовых симбиозов, например, Ruminococcus albus

сбраживает глюкозу в этанол, ацетат и водород вместе с Vibrio succinogenes,

который подхватывает водород и восстанавливает им водород до сукцината.

6. Не все клостридии могут выделять водород, так как у них не имеется гидрогеназы. Например, у Cl.thermoaceticum и Cl.formicoaceticum гексозы окисляются в ацетат и углекислый газ, а электроны используются для восстановления углекислого газа до ацетата. В результате образуется 3 моля ацетата и моль глюкозы.

Восстановление углекислого газа – это обязательная ступень для этих клостридий, потому что они не способны к образованию лактата или этанола,

либо бутирата из ацетил-СоА.

14

1.С6Н12О6 + 2Н2О = 2СН3СОО-+ 2НСО3 +4Н2 энергия, выделяемая =-206 кДж

2.2НСО3 +4Н2 + Н+ = СН3СОО + 4Н2О энергия, выделяемая =105 кДж

Это ацетатное брожение Cl. thermoaceticum .

7. Образование формиата бактериями в энергетическом отношении сравнимо с образованием водорода. Представители родов Shigella и Erwinia,

образуют значительные количества формиата. E. coli и Enterobacter aerogenes

имеют формиатгидрогеназу и в анаэробных условиях расщепляют формиат на углекислый газ и водород, а продукция водорода или формиата увеличивает снабжение организма энергией, так как образуются конечные продукты и больше энергии оказывается доступной для организма.

Некоторые факультативные и облигатные анаэробы в качестве акцепторов электронов используют неорганические соединения или фумарат.

Теорию брожений изучал академик В.Н. Шапошников, он открыл двухфазность бактериальных брожений.

Сущность двухфазности состоит в том, что в первую фазу активно протекающие биосинтетические процессы требуют в больших количествах восстановительных потенциалов. Таким образом, первая фаза характеризуется интенсивным размножением клеток и образованием окисленных продуктов брожения. По мере затухания биосинтетических процессов акцепторами водорода начинают выступать недоокисленные продукты брожения, которые при этом восстанавливаются.

Вторая фаза брожений – это торможение анаболических процессов и образование восстановленных продуктов. В.Н. Шапошников открытие сделал на ацетонобутиловом брожении, в первой фазе которого образуется СО2,

масляная и уксусная кислоты, а вторая фаза предполагает образование ацетона и бутанола.

15

Кбактериям, вызывающим брожение, относятся бактерии рода

Clostridium, Bacteroides ruminicola и другие, живущие в кишечном тракте жвачных животных, ацетогенные бактерии; все они способны использовать кислород как терминальный акцептор электронов.

Брожение вызывают факультативные анаэробы, пропионовокислые,

молочнокислые бактерии, также многие факультативные аэробы, даже облигатные аэробы, хотя для них брожение не является основным способом жизни.

Те организмы, которые сбраживают углеводы в янтарную, пропионовую,

уксусную кислоты и углекислый газ, дают огромную биомассу по сравнению с молочнокислыми бактериями.

Облигатные и аэротолерантные анаэробы, осуществляющие брожение,

живут в кишечном тракте животных, в грязи, в компостах и в воздушной пыли

ввиде спор.

Вестественной среде облигатные анаэробы могут долгое время жить, а в чистой культуре чувствительны к кислороду. Это объясняется тем, что в природе анаэробы живут в микробных комплексах, которые включают в себя утилизирующие кислородные формы.

У аэробов нет субстратной проблемы. Они извлекают 38 молей АТФ и их существование зависит от питательных веществ, чем от энергетических субстратов.

В принципе, брожение – это одна из форм анаэробного метаболизма, при котором конечный акцептор водорода образуется за счет самого субстрата.

Часть молекул окисляется, часть из них восстанавливается. Например, при брожении глюкозы цепочка, состоящая из 6 атомов углерода, вначале соединяется с фосфором (фосфорилируется), а затем расщепляется на две молекулы, содержащие по 3 атома углерода – триозы.

Одна из этих молекул после отщепления фосфора превращается в молекуле пировиноградной кислоты. При образовании пировиноградной

16

кислоты водород отщепляется от одной молекулы триозы и присоединяется к другой части той же молекулы, в результате чего происходит восстановление.

Факультативные анаэробы. Многие микроорганизмы, особенно, бактерии,

имеют два набора ферментных систем, благодаря чему они способны культивироваться в обоих условиях, как в присутствии кислорода, так и в его отсутствии.

Облигатные анаэробы. Некоторые анаэробы не только не способны усваивать атмосферный кислород, но даже отравляются им. К этим микроорганизмам относятся облигатные анаэробы. Облигатные анаэробы культивируются только в атмосфере, где полностью нет кислорода.

Облигатные аэробы. Большинство широко распространенных микробов обладает ферментными механизмами, позволяющими использовать в качестве конечного акцептора водорода только свободный кислород. Они способны расти лишь при свободном доступе воздуха. Такие микроорганизмы называются облигатными аэробами.

В промышленности процессы брожения используются по двум основным путям:

1. сбраживание отдельных партий;

2.непрерывный процесс.

Существуют различные комбинации и модификации этих типов.

Брожение отдельных партий. Бродильный ферментер наполняют заранее приготовленным суслом или другим материалом, предназначенным для сбраживания (разведенной патокой, размельченными клубнями картофеля,

гидролизованными кочерыжками кукурузных початков). рН и температуру доводят до соответствующих значений и добавляют питательные вещества.

Сусло стерилизуется паром в ферментере.

Посевной материал, т.е. чистую культуру соответствующих микробов,

добавляют из специального аппарата, в котором выращивали культуру.

Происходит брожение.

17

В ферментере необходимо поддерживать некоторое избыточное давление, чтобы предотвратить просачивание внутрь загрязненного воздуха. По истечению определенного времени содержимое ферментера сливают и подвергают соответствующей обработке.

Ферментер очищают, и процесс начинается сначала. Брожение в этом случае представляет собой прерывистый процесс, который состоит из сбраживания отдельных партий.

Непрерывный процесс. Некоторые брожения можно вести как непрерывный процесс. Субстрат и посевной материал вводят в ферментер непрерывно с установленной скоростью. Рост клеток происходит непрерывно по мере прохождения субстрата через аппарат.

Полученный продукт или полностью сброженное сусло непрерывно удаляют. В таких аппаратах необходимо поддерживать непрерывную аэрацию

ирН, производить охлаждение или нагревание, добавлять питательные вещества. Должны существовать приспособления для регуляции скорости роста

иудаления мертвых микроорганизмов. Важное значение имеет чистота культуры.

Обычно этот процесс происходит в коническом вращающемся ферментере или соединенных между собой нескольких ферментерах. В один его конец вводится полностью приготовленное сырье, которое вступает в контакт с размножающимися микроорганизмами.

Микроорганизмы воздействуют на субстрат по мере его прохождения по системе. В момент, когда концентрация продукта достигает максимума,

жидкость стекает в специальный резервуар для дальнейшей обработки.

Двухфазные системы. Например, производство уксуса. Первой фазой системы является жидкость, содержащая спирт. Она непрерывно поступает в верхнюю часть окислителя, стекает вниз по аэрируемым опилкам и непрерывно удаляется со дна окислителя в виде уксуса. Вторая фаза системы – пленка

18

Acetobacter, растущих на поверхностях, по которым стекает раствор спирта. На том же принципе основаны фильтры для очистки сточных вод.

Глубинное культивирование. В некоторых промышленных процессах используют строго аэробные микроорганизмы. При выращивании строго аэробного микроорганизма в ферментерах содержимое их перемешивается непрерывно с помощью специальных мешалок и постоянно аэрируется путем пропускания под давлением стерильного воздуха, образующего несколько миллиардов мелких пузырьков. Воздух доставляет кислород и, проходя, через ферментер, удаляет аммиак и углекислый газ.

Вопросы

1.Что такое брожение?

2.Какие виды брожений вы знаете?

3.Что собой представляет молочнокислое брожение?

4.Что собой представляет молочнокислое брожение?

5.Что собой представляет молочнокислое брожение?

6.На какие два типа длятся промышленные процессы брожения?

Дыхательный тип метаболизма

Дыхательный тип метаболизма – это наиболее распространенный способ жизни микроорганизмов. Это относится к микроорганизмам с аэробным типом дыхания.

Дыхание органотрофов начинается с цикла лимонной кислоты (цикла трикарбоновых кислот), в котором происходит полное окисление ацетата,

образованного из конечного продукта гликолиза – пировиноградной кислоты.

Завершается окисление окислительным фосфорилированием в дыхательной цепи.

Окислительное фосфорилирование – связанный с мембраной процесс,

включающий серию последовательных окислительно-восстановительных реакций, связанных с пространственно организованных редокс-переносчиков.

19

Перенос энергии между редокс-системами и энзимным комплексом,

ответственным за синтез АТФ, происходит через энергизованные протоны,

образующие электрохимический градиент.

Перенос электронов сопровождается выбросом Н+ наружу через заряжающие протонные помпы. При этом используется энергия электронов,

переходящих на более низкие энергетические уровни.

Так как мембрана плохо проницаема для Н+, образуется трансмембранный электрохимический градиент протонов. Этот градиент обусловливает перемещение Н+ в обратном направлении через протонные помпы, разряжающие мембрану. Разряжающая протонная помпа представлена ферментным комплексом, образующим образование АТФ из АДФ.

Дыхательный тип свойствен большей части хемогетеротрофов, всем хемолитотрофам и некоторым факультативным фототрофам.

Различают две фазы дыхания: I фаза – ЦТК (цикл трикарбоновых кислот),

II фаза – дыхательная цепь.

ЦТК называют камерой сгорания, в которой сгорают не все вещества, а

только те, которые могут превратиться в интермедиаты ЦТК. В результате одного оборота ЦТК суммарная реакция выглядит, как: ацетат + оксалоацетат = 2 СО2+ оксалоацетат. Оксалоацетат играет каталитическую роль, после окисления ацетатного компонента, он принимает на себя новую молекулу ацетил-СоА,

ЦТК является механизмом окисления не только жиров, но и окисления углеводов и аминокислот, он обеспечивает процессы биосинтеза предшественниками: альфа-кетаглутаровая кислота аминируется с образованием глутаминовой. Янтарная кислота служит предшественником тетрапирролов, из щавелевоуксусной кислоты образуется аспарагиновая кислота. Поэтому ЦТК относят к амфиболическим путям.

20