Физиология и биохимия микроорганизмов. Учебное пособие для студентов специальности 06.01.03 – «Биология» высших учебных заведений

происходит это в результате ряда последовательных превращений, называемых в совокупности циклом Кребса (рис.1., табл. 5).

Рис. 1. Цикл Кребса.

Таблица 5. Цикл Кребса

51

Установлено, что в обычных условиях культивирования микроорганизм расщепляет глюкозу на водород, углекислоту, этиловый спирт, уксусную кислоту, ацетилметилкарбинол, 2,3-бутиленгликоль, триметиленгликоль,

молочную кислоту, глицерин и янтарную кислоту. Некоторые из конечных продуктов метаболизма легко обнаружить в пробирках с культурой, и они часто используются при идентификации микроорганизмов.

Питательные вещества как строительный материал клетки

Организмы различных типов существенно различаются по своим потребностям в питательных веществах, особенно в источниках углерода и энергии. Некоторые автотрофные организмы, например, почвенный микроорганизм Nitrobacter, обладает разнообразными синтетическими потенциями – они образуют аминокислоты, белки, жиры, углеводы, ферменты,

53

витамины и многие другие сложные органические соединения, входящие в

состав живой клетки.

Вотличие от автотрофов многие гетеротрофы с ограниченной способностью к синтезу очень требовательны в отношении питательных веществ. Примером могут быть многочисленные сапрофиты, часто встречающиеся в молоке и сбраживаемых растительных продуктах и различные виды микроорганизмов-паразитов. Этим организмам необходимы кровь, другие ткани и сложные органические вещества, экстрагируемые из крови или других тканей, которые они сами не способны синтезировать, так как набор ферментов

уних ограничен.

Впроцессе синтеза содержимого клетки некоторые атомы и молекулы питательных веществ отбираются, располагаются по-другому и соединяются в новые структуры, из которых состоят протоплазма, клеточная оболочка и т.п. В

этом и состоит ассимиляция. Неиспользованные остатки питательных веществ выделяются в виде отходов.

Реакции, протекающие в процессе синтеза, являются эндергоническими – в сложных молекулах, образующихся в результате процессов синтеза,

происходит накопление энергии. Необходимая для этого энергия освобождается в результате экзергонических процессов диссимиляции или окисления.

Некоторые из эндергонических реакций можно рассматривать как реакции, обратные гидролизу, т.е. образование сложных молекул за счет двух более простых, путем отщепления водорода от одной из них и кислорода – от другой. Водород и кислород соединяясь, образуют молекулу воды. Но процессы биосинтеза протекают намного сложнее – они складываются из множества других химических реакций, кроме реакции, обратной гидролизу.

В биосинтезе важную роль играют процессы полимеризации и конденсации, формируется крупные молекулы в виде длинных цепей путем

54

соединения между собой множества мелких идентичных или почти идентичных единиц. Затем эти цепи удваиваются и скручиваются в спираль.

Некоторые полимеры и продукты конденсации напоминают длинный железнодорожный состав, состоящий из сцепленных между собой повторяющихся единиц. Гидролиз разъединяет эти единицы. Примером полимера является клетчатка (целлюлоза), состоящая из молекул глюкозы.

Часто полимеризация и конденсация происходят спонтанно.

Дополнительные питательные вещества

Существует категория питательных веществ, которые хотя и не служат источником энергии для клетки и не используются в качестве пластического материла для построения ее структурных компонентов, тем не менее,

абсолютно необходимы для роста и эффективны в минимальных количествах.

Это могут быть простые ионы – F+++, Mn ++, Co ++ - или сложные органические соединения. Примером незаменимых сложных органических соединений могут быть витамины.

К категории незаменимых относятся также и некоторые аминокислоты:

они необходимы для роста человека, также для роста бактерий. Например,

триптофан, в отсутствии которого даже на средах, вполне полноценных в других отношениях, не возможен рост таких бактерий, как Salmonella typhi, Clostridium tetani, Corynebacterium diphteriae. Но большинство микроорганизмов способны синтезировать необходимый им триптофан. К

таким микроорганизмам относятся автотрофные бактерии и многие другие,

которые, развиваясь на средах без триптофана, тем не менее, содержат эту аминокислоту.

Роль подобных соединений в питании различных клеток проанализировал Филдс. Например, определенная бактерия нуждается в пантотеновой кислоте,

она необходима для синтеза кофермента А. Предположительно, бактерия способна осуществлять все этапы синтеза пантотеновой кислоты, кроме одного.

55

Из молекулы аммиака бактерия синтезирует незаменимую аминокислоту бета-

аланин.

Но бактерия не способна синтезировать пантоевую кислоту,

необходимую для синтеза пантотеновой кислоты. Стоит добавить несколько миллиграммов пантоевой кислоты, как синтез пантотеновой кислоты завершается и бактерия начинает расти. Без пантоевой кислоты рост невозможен.

Микроорганизмы, которые способны синтезировать пантоевую кислоту или другие компоненты пантотеновой кислоты, не сталкиваются с подобными трудностями, поэтому не нуждаются в пантоевой кислоте.

Ферменты бактерий

Ферменты принимают участие во всех биологических процессах.

Ферменты – это катализаторы, синтезируемые живой клеткой. Катализатором называют соединение, ускоряющее химическую реакцию. Ферменты могут изменять ход реакции между веществами, называемыми субстратами,

происходит это благодаря значительному увеличению концентрации субстратов на поверхности катализатора.

После того, как субстраты изменились или прореагировали между собой,

катализатор возвращается к своему исходному состоянию и оказывается неизмененным. Таким образом, весьма малое количество катализатора может способствовать быстрому превращению большого количества субстрата,

оставаясь при этом в свободном состоянии. Например, 2мл концентрированного фермента трипсина достаточно, чтобы за 5 часов переварить свыше 2 кг промолотого мяса при температуре 370 и рН 7,5.

Все ферменты представляют собой белковые комплексы, они обладают свойствами гидрофильных коллоидов. Они чувствительны к действию различных факторов внешней среды. Активность ферментов снижается при повышении или понижении температуры, при резком изменении реакции

56

среды, повышении осмотического давления и избыточной концентрации субстрата, и конечных продуктов реакции, при действии ультрафиолетовых лучей, повышении концентрации фермента.

Действие некоторых ферментов блокируется специфическими ферментными ядами, к которым относятся сульфамидные препараты,

антибиотики, наркотические вещества, цианиды, красители, сероводород и дезинфицирующие вещества.

Эти вещества часто адсорбируется на активной поверхности катализатора или связывается с ней или химическим радикалом ферментного комплекса и таким образом делают фермент недоступным для субстрата. Некоторые из этих

«блокирующих» или «отравляющих» воздействий обратимы, тогда как под влиянием других происходит окончательная инактивация фермента.

Установлено, что действие многих ферментов обратимо. Многие ферменты животных, дрожжей и грибов удалось выделить в чистом кристаллическом виде. Первым ферментом, полученным в кристаллическом виде, была уреаза, позднее были выделены пепсин, трипсин, амилаза и другие.

Активность ферментов зависит от целостности белковой молекулы и от сохранения коллоидного состояния.

Молекула большинства ферментов состоит из двух составных частей, по отдельности лишенных активности:

а) термолабильная белковая часть, называемая носителем или апоферментом;

б) небелковая, термостабильная часть, называемая коферментом или простетической группой.

Эти две части вместе составляют голофермент или полный фермент.

Некоторые ферменты функционируют только внутри клетки, другие выделяются из клетки и катализируют главным образом реакции гидролиза,

происходящие внеклеточно.

57

Ферменты, находящиеся внутри клетки, называют внутриклеточными или эндоферментами, а ферменты, проявляющие свою активность вне клетки – внеклеточными или экзоферментами.

Экзоферменты катализируют в основном гидролитические реакции.

Эндоферменты катализируют реакции, протекающие внутри клетки. Связанные с синтезом или с освобождением энергии.

Некоторые ферменты образуются в клетке сначала в неактивной форме – в виде зимогенов или проферментов. Они приобретают активность в результате контакта с некоторыми другими соединениями, называемыми киназами,

кофакторами, активаторами.

Характерным свойством ферментов является их специфичность. Под специфичностью подразумевают способность фермента связываться или реагировать лишь с определенным химическим соединением. Часто эта специфичность бывает очень строгой.

Кроме гидролиза, основной реакции расщепления, известны и многие другие ферментативные реакции. К этим реакциям относятся следующие:

Дегидрогенизация – отщепление водорода. Эта реакция является одним из наиболее важных источников энергии у всех живых существ.

Фосфоролиз. В этой реакции остаток фосфорной кислоты вводится в

сложную органическую молекулу с помощью механизма, напоминающего гидролиз. Этот процесс играет важную роль в переносе энергии внутри клетки.

Фосфорилирование заключается в присоединении фосфатной группы к молекуле органического вещества. Это одна из важнейших энергетических реакций, протекающих в клетке.

Окисление путем: а) присоединение кислорода, б) отщепление от водорода (дегидрогенизация).

Декарбоксилирование - отщепление СО2 от карбоксильной группы (-

СООН).

Дезаминирование – отщепление аминогруппы (-NH2).

58

Пермеазы. Некоторые питательные вещества оказываются недоступными для клетки, так как они не могут в нее проникнуть. Клетка может располагать ферментными системами, необходимыми для метаболизма этих недоступных питательных веществ.

Клетки, способные использовать подобные питательные вещества имеют специальные ферменты, называемые пермеазами. Не всегда питательные вещества, проникшие в клетку используются ею.

Некоторые клетки, обладая пермеазной системой, лишены ферментных систем, необходимых для использования проникших в клетку.

В таких случаях питательные вещества накапливаются в клетке и могут быть обнаружены в ней относительно больших количествах.

Адаптивные (индуцированные) и конститутивные ферменты

Все живые клетки имеют естественный набор определенных ферментных систем, который характерен для всех клеток данного типа. Такие ферменты являются нормальной составной частью и называются конститутивными.

Существует и другая группа ферментов, которые появляются в клетке лишь в ответ на действие того или иного внешнего фактора. Эти заново образованные ферменты служат выражением адаптации к новым условиям среды. Их называют адаптивными или индуцированными. Среди факторов,

индуцирующих образование адаптивных ферментов, можно назвать некоторые питательные вещества.

Если клетка, которая в нормальных условиях не способна сбраживать лактозу, находится в контакте с этим сахаром, то в ней начинается синтез фермента лактазы, расщепляющего лактозу, это и есть пример индуцированного фермента. Иногда несколько очень близких между собой в химическом отношении субстратов, называемых индукторами, стимулируют образование одного адаптивного энзима.

59

Биохимические тесты для идентификации бактерий

Бактерии имеют определенные особенности в ферментообразовании и поэтому нужно убедиться в способности неизвестного микроорганизма сбраживать или гидролизовать некоторые углеводы, например, глюкозу,

сахарозу и лактозу.

Необходимо проверить, способен ли микроорганизм использовать в качестве акцептора водорода нитраты и нитриты, вызывать гидролиз желатины,

коагулированной сыворотки, казеина молока, крахмала и жиров.

При проведении всех этих определений важно, чтобы среда и условия инкубации обеспечивали микроорганизмам хороший прирост биомассы, так как, например, если разлагается лактоза с образованием конечных продуктов и выделением газа, то необходимо, чтобы в 1 мл среды, на которой проводится испытание, содержалось не менее от 40 до 390 млн клеток данного микроорганизма.

Следует подчеркнуть, что даже если использовать среды с заранее известным составом, то результаты могут зависеть от таких параметров, как их определенное содержание и качество, от отсутствия или наличия доноров и акцепторов водорода, от рН, температуры и других факторов

Способность микроорганизмов сбраживать сахара с выделением газа или без него, можно легко изучить поместив небольшую пробирку для улавливания выделяющегося газа, так как при сбраживании одного и того же сахарида, один из микроорганизмов сбраживает его с образованием газа, а другой нет.

Способность бактерий образовать газ является доказательством брожения и фактически всегда сопровождается подкислением среды, т.е. накоплением в ней кислот.

Однако брожение часто протекает без образования газа, и в таких случаях единственным доказательством того, что микроорганизм способен сбраживать данный субстрат, служит образование кислоты, иногда образуются щелочи.

60