Учебно-методическое пособие к большому практикуму по биохимии. В двух частях. Ч.2. Биохимия пищевых продуктов

Саратовский национальный исследовательский государственный

университет имени Н. Г. Чернышевского

С о с т а в и т е л и М. В. Каневский, А. А. Галицкая

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

КБОЛЬШОМУ ПРАКТИКУМУ ПО БИОХИМИИ

Вдвух частях

Ч а с т ь 2 Биохимия пищевых продуктов

Учебно-методическое пособие для студентов биологического факультета,

обучающихся по направлению подготовки 06.03.01 «Биология», профиль «Биохимия и физиология процессов адаптации»

Саратов Издательство Саратовского университета

2023

Раздел 1. МОЛОКО

1.1. Определение сухого вещества

Сущность методов определения массовой доли влаги и сухого вещества основана на высушивании навески исследуемого продукта при постоянной температуре. Колебания в содержании сухих веществ в молоке у разных животных составляют: у коров – 11,3–14,5; овец – 14,6–23,3;

коз – 10,8–18,2; буйволиц – 15,6–19,5; верблюдиц – 13,4–15,9; кобыл – 10,2–11,1%.

К сухим веществам молока относятся молочный сахар, молочный жир, молочный белок, ферменты, витамины, минеральные вещества. Содержание сухих веществ в молоке – это параметр, который строго регламентирован в нормативных документах (ГОСТ или ТУ). Если в продукте содержится менее 11% сухих веществ, говорят уже не о молоке, а о молокосодержащем продукте.

Реактивы и материалы:

–весы,

–фарфоровая чаша для выпаривания,

–кислота соляная, концентрированная,

–песок,

–сито с диаметром отверстий 1–1,5 мм,

–стеклянная палочка,

–сухожаровой шкаф.

Подготовка материалов

Песок просеивают через сито с отверстиями диаметром 1–1,5 мм и отмучивают водопроводной водой. Затем приливают соляной кислоты, разведённой в 2 раза, столько, чтобы песок был полностью покрыт ею, перемешивают стеклянной палочкой, дают отстояться в течение 20 мин. Слив соляную кислоту, ещё раз приливают соляной кислоты, разведённой в 2 раза, столько, чтобы песок был полностью покрыт ею, перемешивают стеклянной палочкой, дают отстояться в течение 20 мин. После этого кислоту сливают, промывают песок водопроводной водой до нейтральной реакции (по индикаторной бумаге), затем промывают однократно дистиллированной водой, высушивают и прокаливают в сушильном шкафу при температуре 102 ± 2 °С в течение 2 ч. Хранят песок в банке с плотно закрытой пробкой.

3

Проведение анализа

Фарфоровую чашу с 5–10 г хорошо промытого и прокаленного песка взвешивают, записывая результат до 4-го знака после запятой (m0). В эту же чашу пипеткой вносят 1 мл исследуемого объекта и немедленно взвешивают, записывая результат до 4-го знака после запятой (m).

Затем содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой и чашу помещают в сушильный шкаф с температурой 102 ±2 °С. По истечении 2 ч чашу вынимают из сушильного шкафа, охлаждают и взвешивают. Далее чашу снова убирают в сушильный шкаф с температурой 102 ± 2 °С на 30 мин. После этого вынимают, охлаждают и взвешивают. Взвешивание производят до тех пор, пока разность между двумя последовательными взвешиваниями будет равна или менее 0,01 г (m1).

Обработка результатов

Массовую долю сухого вещества C, %, вычисляют по формуле

где m0 – масса чаши для выпаривания с песком и стеклянной палочкой, г; m – масса бюксы с песком, стеклянной палочкой и навеской исследуемого продукта до высушивания, г; m1 – масса бюксы с песком, стеклянной палочкой и навеской исследуемого продукта после высушивания, г.

1.2. Определение буферной емкости молока (по П. Ф. Дьяченко)

Буферные свойства – это способность растворов (содержащих слабую кислоту и ее соль, образованную сильным основанием, смесь двух кислых солей слабой кислоты или слабое основание и его соль, образованную сильной кислотой) препятствовать изменению pH при добавлении кислот или щелочей.

Буферные свойства молока связаны с наличием белков, фосфатов и цитратов натрия и калия.

Кислота, добавленная в молоко или образованная в результате молочнокислого брожения, связывается белками в соответствии с уравнением

Константа диссоциации карбоновых кислот мала, поэтому активная кислотность практически не изменяется, а титруемая возрастает.

4

Буферная способность молока по кислоте, обусловленная фосфатами, заключается в переходе гидрофосфатов в дигидрофосфаты:

HPO24− + H+ −−→ H2PO−4

Константа диссоциации аниона H2PO−4 значительно ниже, чем константа диссоциации соляной или молочной кислоты, поэтому происходит связывание ионов водорода, pH не изменяется, титруемая кислотность возрастает.

Аналогично реагируют с кислотой цитраты и гидрокарбонаты. Щелочь, добавленная к молоку, связывается белками в соответствии с уравнением

Буферная емкость молока по щелочи, связанная с фосфатами, заключается в переходе дигидрофосфатов в гидрофосфаты:

HPO−4 + OH− −−→ HPO24− + H2O

Цитраты и гидрокарбонаты взаимодействуют со щелочью аналогично фосфатам.

Количественной мерой буферных свойств молока является буферная емкость. Под буферной емкостью понимают объем (мл) раствора гидроксида натрия с C = 0,1 моль/л или раствора соляной кислоты той же концентрации, который требуется прибавить к 100 мл молока, чтобы изменить pH молока на единицу.

Буферная емкость нормального молока по кислоте составляет около

1,74, а по щелочи – 1,08.

Буферные свойства молока играют большую роль при изготовлении кисломолочных продуктов и сыра. Так, при выработке кисломолочных продуктов микроорганизмы закваски способны сбраживать около 20% лактозы, после чего начинают отмирать из-за низкого значения pH (4,76). Наибольшей буферной емкостью среди молочных продуктов обладают сыры, поэтому pH сырной массы понижается медленно до значения 5,3– 5,5. При таком pH продолжается развитие молочнокислых стрептококков закваски, в результате чего лактоза полностью сбраживается на 7–10-е сутки созревания сыра. Если бы процесс молочнокислого брожения проходил в водном растворе лактозы, содержащем столько же лактозы, сколько в молоке, микроорганизмы начали бы отмирать, утилизировав только около 3% лактозы.

5

Реактивы и материалы:

–бюретка вместимостью 10 мл и ценой деления 0,1 мл,

–конические колбы вместимостью 150 мл,

–пипетка вместимостью 10 мл,

–раствор гидроксида натрия (C = 0,1 моль/л),

–раствор метилового красного спиртовой (C = 0,1%),

–раствор фенолфталеина спиртовой (C = 1%),

–соляная кислота (C = 0,1 моль/л).

Проведение анализа

Вдве конические колбы вместимостью 150 мл пипеткой вносят по 10 мл молока.

Водну из них добавляют 3 капли 1%-го раствора фенолфталеина

и титруют из бюретки раствором гидроксида натрия (C = 0,1 моль/л) до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Объем щелочи (Vщ) записывают.

В другую колбу с молоком добавляют 500 мкл 1%-го раствора метилового красного и титруют из бюретки раствором соляной кислоты (C = = 0,1 моль/л) до появления красного окрашивания. Объем кислоты (Vк) записывают.

Обработка результатов

Буферную емкость молока по щелочи (Бщ) вычисляют по формуле

где Kщ – объем раствора гидроксида натрия, израсходованного на титрование 100 мл молока, (Kщ = Vщ·10); Kк – объем раствора соляной кислоты, израсходованного на титрование 100 мл молока, см3 (Kк = Vк·10); pHнач – значение pH исследуемого молока; pHкон – значение pH молока в конце титрования щелочью или кислотой (при титровании щелочью pHнач 8,2, а при титровании кислотой pHкон 4,7); 10 – коэффициент пересчета растворов щелочи или кислоты с эквивалентной концентрацией 0,1 моль/л в концентрацию 1 моль/л.

6

1.3. Определение массовой доли белка молока индикаторным способом. Формольное титрование

Метод основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков молока раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

В качестве индикатора используют фенолфталеин, приобретающий окраску в щелочной среде.

Реактивы и материалы:

–коническая колба вместимостью 100 мл,

–раствор гидроксида натрия (C = 0,1 моль/л),

–раствор сульфата кобальта (C = 2,5%),

–раствор фенолфталеина спиртовой (C = 1%),

–формалин технический (C = 36,5–37,5%).

Проведение анализа

В колбу вместимостью 100 мл отмеривают 20 мл молока, 0,25 мл 1%-го раствора фенолфталеина и титруют раствором гидроксида натрия с концентрацией 0,1 М до появления розовой окраски, соответствующей цвету эталона (смешивают 20 мл молока и 0,5 мл 2,5%-го раствора сульфата кобальта). Затем вносят 4 мл технического формалина и вновь титруют раствором гидроксида натрия с концентрацией 0,1 М до появления окраски эталона (V).

Обработка результатов

Количество щелочи, пошедшее на второе титрование (при первом титровании она расходуется на нейтрализацию веществ, обусловливающих кислотность молока), умножают на коэффициент 0,9591 и получают массовую долю белков в молоке, ω, %:

где V – количество щелочи, пошедшее на второе титрование, мл.

1.4.Определение массовой доли белка молока

сиспользованием амидо чёрного

Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислый краситель, образуя с ним нерастворимый осадок, после удаления которого измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора.

7

Реактивы и материалы:

–кислота серная концентрированная,

–конические колбы вместимостью 100 мл,

–краситель амидо черный 10 Б в фосфатно-цитратном буфере,

–мерные колбы вместимостью 50 мл,

–раствор гидроксида натрия (C = 40%),

–ФЭК или спектрофотометр,

–центрифуга.

Подготовка реактивов

Приготовление раствора красителя. 4,6 г красителя амидо черного растворить в 200 мл воды. Добавить 400 мл фосфатно-цитратного буфера (в 1 л раствора содержится 21 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 79,25 г лимонной кислоты). Доводят объём дистиллированной водой до 2 л. Измеряют значение рН полученного раствора: оно должно быть 2,3 ± 0,1 ед. рН. Если рН раствора не соответствует данному значению, добавляют концентрированную серную кислоту или раствор с массовой долей гидроокиси натрия 40%.

Раствор, разбавленный дистиллированной водой в 50 раз, должен иметь оптическую плотность 0,82±0,02 при длине волны 590 нм в кювете с рабочей длиной 10 мм при измерении против дистиллированной воды. Если оптическая плотность раствора не соответствует данному значению, исправляют ее добавлением буферного раствора или раствора красителя.

Проведение измерений

В стеклянную колбу пипеткой отмеряют 1 мл молока, добавляют 20 мл раствора красителя и перемешивают содержимое. СЛЕ- ДУЕТ ИЗБЕГАТЬ ВСТРЯХИВАНИЯ, ТАК КАК ПРИ ЭТОМ ОБРАЗУЕТСЯ ТРУДНОРАЗРУШИМАЯ ПЕНА! 2 мл раствора центрифугируют

10 мин при скорости вращения 1500 об/мин. Отбирают пипеткой 1 мл надосадочной жидкости, переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доливают до метки дистиллированной водой и перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл раствора красителя, объем раствора доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя по отношению к анализируемой пробе. После измерения кювету промывают буферным раствором,

8

где 7,78 – эмпирический коэффициент; D – измеренная оптическая плотность, ед. оптической плотности; 1,34 – эмпирический коэффициент.

1.5. Определение массовой доли казеина в молоке методом кислотного осаждения

Казеин молока обладает кислыми свойствами и поэтому способен взаимодействовать со щелочью. Массовую долю казеина можно определить по разнице объемов щелочи, пошедшей на нейтрализацию молока

ибесказеиновой сыворотки.

Воснове получения бесказеиновой сыворотки лежит кислотная коагуляция казеина в изоэлектрической точке (ИЭТ), соответствующей pH 4,6– 4,7. Механизм процесса заключается в том, что при подкислении молока происходит постепенная нейтрализация отрицательных групп (карбоксильных и фосфатных) казеина и удаление из состава казеиновых мицелл коллоидного фосфата кальция. При pH 4,9 наступает потеря частицами всего коллоидного фосфата кальция и полное разрушение мицеллярной структуры. Дальнейшее понижение pH раствора до ИЭТ приводит к нейтрализации казеиновых частиц и снижению степени их гидратации. Изоэлектрическое состояние сопровождается конформационным изменением полипептидных цепей макромолекул казеина внутри субмицелл, а это приводит к частичной гидрофобизации их поверхности и образованию нерастворимых в водной среде агрегатов.

Дальнейшее объединение субмицелл за счет гидрофобных, водородных и, в меньшей степени, ионных связей приводит к образованию геля.

Реактивы и материалы:

–бумажные фильтры,

–бюретка вместимостью 25 мл с ценой деления 0,1 мл,

–колбы конические вместимостью 100 и 200 мл,

–мерная пипетка вместимостью 5 мл,

–раствор гидроксида натрия (C = 0,1 М),

–раствор фенолфталеина спиртовой (C = 1%),

–серная кислота (C = 0,05 М),

–цилиндр мерный вместимостью 100 мл.

Проведение измерений

1-й этап. В коническую колбу вместимостью 200 мл вносят 20 мл молока. Массу молока измеряют и записывают. Далее вносят 80 мл дистиллированной воды, содержимое колбы перемешивают и титруют из бюретки раствором серной кислоты (C = 0,05 М) при слабом постоянном помешивании до тех пор, пока казеин не выпадет в осадок хлопьями. Для

9

контроля полноты выпадения казеина определяют pH, пользуясь индикаторной бумажкой. ИЭТ казеина соответствует pH = 4,6–4,7. Объем раствора серной кислоты (Vk), пошедшей на осаждение казеина, записывают.

Через 3–5 мин после образования осадка казеина жидкость фильтруют через сухой складчатый фильтр в коническую колбу вместимостью 200 мл. Далее 50 мл фильтрата мерной пипеткой переносят в коническую колбу вместимостью 100 мл, добавляют 3–5 капель 1%-го спиртового раствора фенолфталеина и титруют раствором гидроксида натрия (C = 0,1 М) до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Объем щелочи (V1), пошедшей на титрование, записывают.

2-й этап. В коническую колбу вместимостью 200 мл пипеткой вносят 20 мл молока, 80 мл дистиллированной воды, столько же серной кислоты (C = 0,05 М), сколько потребовалось на осаждение казеина на первом этапе, и 3–5 капель 1%-го раствора фенолфталеина. Содержимое колбы перемешивают и титруют раствором гидроксида натрия так же, как описано выше. Объем раствора щелочи, пошедшей на титрование, записывают.

Обработка результатов

Поскольку на первом этапе работы брали только 50 мл фильтрата, вначале рассчитывают объем щелочи X, V, мл, который пошел бы на титрование всего раствора (молоко + вода + кислота). Пользуются расчетной формулой

50

где Vk – объем раствора серной кислоты, израсходованной на осаждение казеина, мл; V1 – объем раствора серной кислоты, израсходованной на титрование 50 мл фильтрата, см3; 50 – исходный объем раствора, мл.

Массовую долю казеина K, %, рассчитывают по формуле

где V2 – объем раствора гидроксида натрия, израсходованного на титрование на втором этапе работы, мл; X – рассчитанный объем раствора гидроксида натрия, израсходованного на титрование на первом этапе, мл; 0,1131 – масса казеина, соответствующая 1 мл раствора гидроксида натрия с эквивалентной концентрацией 0,1 М, г; m – масса молока, взятая на исследование, г.

1.7. Определение массовой доли углеводов методом Дюбуа

Фенол-сернокислотный колориметрический метод до сих пор представляет собой удобный метод для быстрого определения общего содержания углеводов в различных экстрактах. Метод Дюбуа сводится к кислотному гидролизу полисахаридов концентрированной серной кислотой

10