Учебно-методическое пособие к большому практикуму по биохимии. В двух частях. Ч.2. Биохимия пищевых продуктов

Раздел 3. ФРУКТЫ И ОВОЩИ

3.1.Количественное определение фруктозы модифицированным методом Роя

Определение фруктозы основано на реакции Селиванова. При нагревании фруктозы и других кетогексоз в присутствии кислоты образуется оксиметилфурфурол, который при реакции с резорцином образует окрашенный продукт вишнево-красного цвета.

Хотя эту реакцию дают также и альдогексозы (например, глюкоза), скорость образования оксиметилфурфурола из фруктозы во много раз выше, что и обусловливает специфичность этой реакции для фруктозы.

Реактивы и материалы:

–бензойная кислота (C = 0,2%),

–водяная баня,

–кислота соляная (C = 30%),

–раствор резорцина,

–растительный материал (неярко окрашенные фрукты, овощи),

–трихлоруксусная кислота (C = 10%),

–фарфоровая ступка с пестиком,

–фруктоза,

–ФЭК или спектрофотометр,

–центрифуга.

Подготовка реактивов

Раствор резорцина. 25 мг резорцина и 65 мг тиомочевины растворить в небольшом количестве ледяной уксусной кислоты. Довести полученный объём до 25 мл.

21

Построение калибровочной кривой

Подготовить растворы фруктозы в 0,2% бензойной кислоте с содержанием фруктозы 25, 20, 15, 10, 5 мг/мл.

0,2 мл полученного гомогената перенести в другую пробирку, добавить 1,8 мл воды и тщательно перемешать. Затем добавить 1 мл 10%-го раствора ТХУ и снова перемешать. К полученной смеси прибавить 1 мл раствора резорцина и 7 мл раствора HCl. Содержимое пробирок тщательно перемешать и прогреть в кипящей водяной бане в течение 15 мин до появления окраски. Пробирки охладить, колориметрировать на ФЭК при 540 нм против контрольного образца, в котором вместо раствора со стандартной концентрацией добавлен равный объем дистиллированной воды.

Проведение анализа

Кусочек плода (5 г) растереть в ступке с 5 мл дистиллированной воды до гомогенного состояния. Полученный гомогенат отцентрифугировать (5 мин, 10 000·g). 0,2 мл полученного супернатанта перенести в другую пробирку, добавить 1,8 мл воды и тщательно перемешать. Затем добавить 1 мл 10%-го раствора ТХУ и снова перемешать. К полученной смеси прибавить 1 мл раствора резорцина и 7 мл раствора HCl. Содержимое пробирок тщательно перемешать и прогреть в кипящей водяной бане в течение 15 мин до появления окраски. Пробирки охладить, колориметрировать на ФЭК при 540 нм против контрольного образца, в котором вместо гомогената добавлен равный объем дистиллированной воды.

3.2. Определение количества углеводов методом Дюбуа без предварительного гидролиза

Фенол-сернокислотный метод удобен для быстрого определения общего содержания углеводов. Метод Дюбуа сводится к кислотному гидролизу полисахаридов концентрированной серной кислотой с последующим добавлением фенола, который образует с моносахаридами окрашенные продукты, и последующим измерением оптической плотности получившегося раствора. В случае легкорастворимых углеводов гидролиз, предваряющий анализ, проводить необязательно.

Реактивы и материалы:

–глюкоза,

–растительный материал (фрукты, овощи),

–серная кислота концентрированная,

–фенол (C = 5%),

–ФЭК или спектрофотометр.

22

Построение калибровочного графика

Подготовить стандартные растворы с известной концентрацией. 1. Последовательное двукратное разведение:

200 мкг/мл – 100 мкг/мл – 50 мкг/мл – 25 мкг/мл – 12,5 мкг/мл 2. Последовательное разведение

а затем 1 мл H2SO4конц. Пробирки оставляют на 10 мин, затем измеряют поглощение при 490 нм. Стандартную кривую строят, используя глюкозу или галактозу.

Проведение измерений

Фрукт или овощ тщательно растирают с водой в ступке, добавляя воду из соотношения на 1 г фрукта или овоща 1 мл воды. Полученный экстракт центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин. В дальнейшем используют надосадочную жидкость (супернатант).

К 0,2 мл предварительно разведённого в 500 экстракта добавля-

ют 0,2 мл 5%-го фенола, а затем 1 мл H2SO4конц. Пробирки оставляют на 10 мин, затем измеряют поглощение при 490 нм.

3.3.Метод определения количества углеводов

сантроновым реактивом

Метод основан на дегидратации моносахаров и формировании гидроксиметилфурфурола, образующего при реакции с антроном комплексное соединение синевато-зеленого цвета. Интенсивность образовавшейся окраски прямо пропорциональна содержанию сахаров в реакционной среде.

Пропорциональная зависимость интенсивности окраски от содержания сахаров в испытуемом растворе соблюдается в области концентраций моносахаров 20–100 мкг/мл.

Реактивы и материалы:

–антроновый реактив,

–ФЭК или спектрофотометр,

–ТФУ (4 моль/л).

23

Подготовка реактивов. Антроновый реактив (C = 0,2%) 200 мг антрона помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют смесь концентрированной серной кислоты с водой в соотношении 19 : 1, тщательно перемешивают и помещают в темное место до полного растворения.

Проведение анализа

Приготовление раствора сравнения. В охлажденную на бане со льдом пробирку с 3 мл воды приливают 6 мл антронового реактива, перемешивают и немедленно нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин, затем охлаждают.

Приготовление стандартного раствора. В мерную колбу вместимо-

стью 100 мл помещают 100 мг стандартного образца глюкозы, растворяют в воде, затем доводят водой до метки и перемешивают. Отбирают 2 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки и перемешивают. Полученный раствор содержит 20 мкг/мл глюкозы.

В пробирку помещают 3 мл стандартного раствора, охлаждают в бане со льдом до 0 °С, приливают 6 мл антронового реактива, перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин, охлаждают и измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Пробоподготовка и проведение анализа. Если в качестве образца используют целый фрукт / овощ или пюре, его тщательно растирают с водой в ступке, добавляя воду из соотношения 1 г фрукта или овоща на 1 мл воды. Полученный экстракт центрифугируют 10 мин при

10 000 об/мин.

К200 мкл экстракта добавляют 2 мл ТФУ (трифторуксусная кислота) (C = 4 моль/л), плотно закрывают пробирку и кипятят 1,5 ч. Затем гидролизат количественно переносят в круглодонную колбу и выпаривают досуха 2 раза, прибавляя воду для удаления ТФУ. Затем экстракт растворяют в 2 мл воды и центрифугируют для удаления нерастворимых взвесей.

К3 мл предварительно разбавленного в 50 раз и охлажденного до 0 °С

вбане со льдом гидролизата приливают 6 мл антронового реактива, перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин, охлаждают и измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Количество углеводов в 1 мл гидролизата определяют по зависимости оптической плотности стандартного образца глюкозы в 1 мл растворителя.

Итоговый результат выражают в мг углеводов на г плода.

24

3.4. Колориметрический метод определения доли редуцирующих сахаров

Метод основан на колориметрировании избытка щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия после реакции с редуцирующими сахарами объекта исследования. При этом гексацианоферрат (III) восстанавливается до гексацианоферрата (II), что ведет к ослаблению окраски, так как К3[Fe(СN)6] окрашен значительно интенсивнее, чем К4[Fe(СN)6].

Реактивы и материалы:

–исследуемый материал – фрукты, овощи,

–гидроксид калия или натрия (C = 2 моль/л),

–глюкоза,

–кислота соляная (C = 1 моль/л),

–раствор гексацианоферрата (III) калия.

в небольшом количестве дистиллированной воды. Затем оба раствора сливают в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доводят до метки дистиллированной водой.

Построение калибровочного графика

Приготовление стандартного раствора глюкозы. 0,16 г глюкозы рас-

творить в 100 мл дистиллированной воды

Построение калибровочного графика. В 6 пробирок вносят пипеткой по 2,5 мл щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и по 0,7; 0,75; 0,8; 0,85; 0,9; 0,95 мл стандартного раствора глюкозы. Далее соответственно приливают 0,9; 0,85; 0,8; 0,75; 0,7; 0,65 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирок нагревают до кипения и кипятят в течение 1 мин. Затем охлаждают и измеряют оптическую плотность на ФЭК со светофильтром, имеющим λ = 440 нм (синий светофильтр). В качестве раствора сравнения используют пробирку, содержащую 2,5 мл щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и 1,6 мл дистиллированной воды.

Строят график зависимости величины оптической плотности от концентрации глюкозы в растворе.

Проведение анализа

Определение количества редуцирующих сахаров. Фрукт или овощ тщательно растирают с водой в ступке, добавляя воду из соотношения 1 г

25

фрукта или овоща на 1 мл воды. Полученный экстракт центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин. В дальнейшем используют надосадок.

В пробирку вносят 1 мл раствора пробы, 0,6 мл дистиллированной воды и затем 25 мл щелочного раствора гексацианоферрата калия. Колбу нагревают до кипения, кипятят 1 мин, охлаждают и измеряют оптическую плотность при λ = 440 нм. В качестве раствора сравнения используют пробирку, содержащую 2,5 мл щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и 1,6 мл дистиллированной воды.

Определение общего содержания сахаров. Для определения общего сахара проводят гидролиз сахарозы. В пробирку отмеривают пипеткой 1 мл приготовленной вытяжки объекта и 4 мл 1 М раствора хлороводородной кислоты. Пробирку с раствором кипятят в течение 1 мин, охлаждают до комнатной температуры. Затем вносят 2 мл 2 М раствора гидроксида натрия (или калия) для нейтрализации кислоты и 25 мл щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия. Содержимое колбы доводят до кипения и кипятят 1 мин, охлаждают и измеряют оптическую плотность при λ = = 440 нм. В качестве раствора сравнения используют пробирку, содержащую 2,5 мл щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и 1,6 мл дистиллированной воды.

Обработка результатов

Количество редуцирующих сахаров (Xpc) в продукте, %, находят

где M – количество глюкозы, найденное по калибровочному графику, мг; V – объем исследуемого раствора, приготовленного из навески, мл; m – масса навески объекта исследования, г.

Общее количество сахаров (Xоc) в продукте, %, находят по формуле

где M – количество глюкозы, найденное по калибровочному графику, мг; V – объем исследуемого раствора, приготовленного из навески, мл; m – масса навески объекта исследования, г.

3.5. Качественный анализ содержания углеводов без предварительного гидролиза методом ТСХ

Качественной характеристикой в методе тонкослойной хроматографии является показатель Rf (подвижность). Сравнивая Rf свидетелей и исследуемых углеводов, проводят их идентификацию.

26

Реактивы и материалы:

–водные растворы свидетелей (глюкозы, фруктозы, галактозы, рамнозы, мальтозы, лактозы, сахарозы) (C = 5%),

–исследуемые объекты – сок, фрукты или овощи, мёд,

–окрашивающий реагент,

–пластинки силуфола,

–разделяющая смесь (элюент),

–сухожаровой шкаф,

–хроматографическая камера.

Подготовка реактивов

Разделяющая смесь. Смешать н-бутанол, ледяную уксусную кислоту и воду (60 : 15 : 25). Интенсивно встряхнуть.

Окрашивающий реагент. 2 г дифениламина растворить в смеси, состоящей из н-бутанола (60 мл), воды (25 мл), уксусной кислоты (15 мл), фосфорной кислоты (10 мл) и анилина (1 мл).

Проведение анализа

На пластинку наносят 1 мкл 5%-го водного раствора сахаров, отступая от бокового и нижнего краев пластинки на расстояние 10 мм. Также наносят 1 мкл сока. Если в качестве образца целый фрукт / овощ или пюре, его тщательно растирают с водой в ступке, добавляя воду из соотношения 1 г фрукта или овоща на 1 мл воды. Полученный экстракт центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин.

Если в качестве объекта используют мёд, его разводят в 5 раз дистиллированной водой и нагревают.

На хроматографическую пластинку наносят 2 мкл экстракта. Пластинку вертикально помещают в камеру, которая заполнена разделяющей смесью (элюентом) до высоты 5 мм.

Пластинку выдерживают в камере до тех пор, пока высота подъема фронта восходящего растворителя не достигнет отмеченной длины разделительного пути. Разделительный путь (расстояние от линии старта до фронта растворителя) равен 90 мм. По окончании хроматографического разделения пластинку вынимают из камеры и сушат при комнатной температуре до полного испарения остатков растворителей.

Затем разделение повторяют в той же системе растворителей. Высушенные пластинки погружают в окрашивающий реагент. Пластинки снова высушивают и проявляют в сухожаровом шкафу при температуре 120°C в течение 5 мин. Проявленные фракции имеют разную окраску на белом фоне пластинок.

Идентификацию сахаров проводят с помощью свидетелей, по значениям Rf . Данные заносят в табл. 2 в графу для расчетных значений.

По результатам исследования делается вывод о качественном составе исследуемого образца.

27

3.6. Качественный анализ моносахаридного состава плодов методом ТСХ

Качественной характеристикой в методе тонкослойной хроматографии является показатель Rf (подвижность). Сравнивая Rf свидетелей и исследуемых углеводов, проводят их идентификацию.

Реактивы и материалы:

–исследуемые объекты – сок, фрукты или овощи, мёд,

–растворы свидетелей (глюкозы, фруктозы, галактозы, рамнозы) (C =

= 1%),

–разделяющая смесь (элюент),

–окрашивающий реагент,

–хроматографическая бумага,

–хроматографическая камера,

–сухожаровой шкаф,

–ТФУ (C = 4 моль/л).

Подготовка реактивов

Разделяющая смесь. В качестве растворителя применяют смесь пиридина, этилацетата, воды и уксусной кислоты, взятых в объёмном соотношении 5 : 5 : 3 : 1. За час до проведения хроматографии на дно сосуда налить растворитель, плотно закрыть и оставить для насыщения камеры парами растворителя.

Окрашивающий реагент. В делительную воронку наливают смесь н-бутанола и воды в объёмном соотношении 4 : 5 и после отстаивания используют органическую (верхнюю) фазу.

28

0,93 мл свежеперегнанного (бесцветного) анилина или 1 г 1,2,3-анизи- дина и 1,66 г фталевой кислоты растворяют в100 мл насыщенного водой н-бутанола.

Проведение анализа

Если в качестве образца целый фрукт / овощ или пюре, его тщательно растирают с водой в ступке, добавляя воду из соотношения 1 г фрукта или овоща на 1 мл воды. Полученный экстракт центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин. Если в качестве образца выступает сок, то его разбавляют в 2 раза водой.

Если в качестве объекта используют мёд, его разводят в 5 раз дистиллированной водой и нагревают.

К 200 мкл экстракта или сока добавляют 2 мл ТФУ (C = 4 моль/л), плотно закрывают пробирку и кипятят 4 ч при t = 100 °С. Затем гидролизат количественно переносят в круглодонную колбу и выпаривают досуха 2 раза, прибавляя воду для удаления ТФУ. Затем экстракт растворяют в 2 мл воды и центрифугируют для удаления нерастворимых взвесей.

На пластинку наносят 1 мкл 1%-го водного раствора моносахаровсвидетелей, отступая от бокового и нижнего краев пластинки на расстояние 10 мм. Также наносят 5 мкл гидролизата. Пластинку вертикально помещают в камеру, которая заполнена разделяющей смесью (элюентом) до высоты

5 мм.

Пластинку выдерживают в камере до тех пор, пока высота подъема фронта восходящего растворителя не достигнет отмеченной длины разделительного пути. Разделительный путь (расстояние от линии старта до фронта растворителя) равен 90 мм. По окончании хроматографического разделения пластинку вынимают из камеры и сушат при комнатной температуре до полного испарения остатков растворителей.

Проявление осуществляют посредством окрашивания раствором анизидинфталата с последующим нагревом до 115 °С.

Расшифровка результатов производят сравнением Rf свидетелей и компонентов смеси (см. работу 3.5).

3.7. Количественное определение содержания аскорбиновой кислоты методом титрования

Принцип метода количественного определения витамина С основан на его способности восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол, который в щелочной среде имеет синюю окраску, а в восстановленном состоянии бесцветный.

Количественное определение витамина С проводят, титруя исследуемый раствор, подкисленный соляной кислотой, щелочным раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола. Пока в титруемом растворе содержится витамин С, приливаемый щелочной раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола будет

29

обесцвечиваться за счет образования восстановленной формы аскорбиновой кислоты. Как только все количество витамина С, имеющееся в исследуемом растворе, окислится, 2,6-дихлорфенолиндофенол не будет восстанавливаться и титруемый раствор приобретет розовую окраску за счет перехода щелочного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола синего цвета в 2,6- дихлорфенолиндофенол красного цвета в кислой среде.

Реактивы и материалы:

–конические колбы вместимостью 100 мл,

–раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДФИ),

–растительный материал (фрукты и овощи),

–соляная кислота (C = 2%),

–ступки и пестики,

–центрифуга.

Подготовка материалов

2,6-дихлорфенолиндофенол, 0,001 н. Для приготовления этого раствора применяют буферную фосфатную смесь по Серенсену, так как индикатор в водном растворе довольно быстро разрушается. Приготовить водные растворы А (КН2РО4 9,078 г в 1 л) и Б (Nа2НРО4·2Н2О 11,867 г в 1 л). Растворы хранят отдельно. Перед приготовлением раствора красителя их смешивают в соотношении 2 : 3, тогда рН 6,9–7,0. Если рН не соответствует заданным значениям, титруют или натриевой щёлочью, или фосфорной кислотой. К 250 мг красителя приливают 700 мл дистиллированной воды и 300 мл буферной смеси. Перед использованием фильтруют или центрифугируют, если есть осадок.

Проведение анализа

Точную навеску исследуемого материала (сухие ягоды шиповника – 1 г, хвоя – 1 г, капуста – 5 г, картофель – 5 г) тщательно растирают в фарфоровой ступке с 4 мл 2%-й соляной кислоты. Затем без потерь переносят содержимое ступки в мерную колбу на 25 мл, несколько раз смывая ступку водой и сливая ее по стеклянной палочке в ту же колбу, и доводят объём раствора дистиллированной водой до метки. Полученную смесь оставляют на 5–10 мин. Содержимое колбы тщательно перемешивают, центрифугируют при 10 000 об/мин в течении 10 мин. Супернатант используют для определения витамина С.

Для титрования отмеривают в коническую колбочку 5 мл супернатанта, добавляют 4 мл 2%-го раствора соляной кислоты и титруют из бюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розового окрашивания, не исчезающего около 30 с. В контрольной пробе вместо вытяжки берется соответствующий объем смеси из 4 мл 2%-й соляной кислоты и 21 мл воды.

30