Учебно-методическое пособие к большому практикуму по биохимии. В двух частях. Ч.2. Биохимия пищевых продуктов

Обработка результатов

Расчет количества аскорбиновой кислоты в пробе производят по фор-

муле

где X – содержание аскорбиновой кислоты, миллиграмм-проценты; A – количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, мл, израсходованное на титрование, за вычетом контроля; C – количество мл вытяжки, взятое для титрования; B – общее количество вытяжки, мл; D – количество вещества в граммах, взятое для анализа; 100 – количество граммов исследуемого материала, взятое для вычисления процентного содержания.

Для достижения аналитической точности эксперимент выполняют

втрёх аналитических повторностях.

3.8.Количественное определение витамина С в продуктах

питания методом йодометрии

Аскорбиновая кислота (витамин С) выполняет жизненно важные функции в организме – принимает участие в окислительно-восстановительных реакциях в качестве кофермента оксидоредуктаз.

В пищевых продуктах витамин С содержится как в восстановленной (аскорбиновая кислота), так и в окисленной форме (дегидроаскорбиновая кислота). Количественные химические методы определения аскорбиновой кислоты основаны на ее восстановительных свойствах.

Реактивы и материалы:

–раствор йода спиртовой (C = 5%),

–раствор крахмала (C = 1%),

–растительные объекты (фрукты и овощи),

31

–соляная кислота (C = 2%),

–ступка и пестик,

–центрифуга.

Подготовка материалов

Раствор йода спиртовой. Для приготовления раствора йода 2 г калия йодистого растворить в 40 мл смеси воды и этилового спирта (1 : 1). В полученной смеси растворить 5 г металлического йода. Когда йод полностью растворится, довести объём раствора до 100 мл этиловым спиртом (возможно использование аптечной спиртовой настойки йода). Перед проведением анализа развести полученный раствор в 40 раз.

Проведение анализа

Точную навеску исследуемого материала (сухие ягоды шиповника – 1 г, хвоя – 1 г, капуста – 5 г, картофель – 5 г) тщательно растирают в фарфоровой ступке с 4 мл 2%-й соляной кислоты. Затем без потерь переносят содержимое ступки в мерную колбу на 50 мл, несколько раз смывая ступку водой и сливая ее по стеклянной палочке в ту же колбу, и доводят объём раствора дистиллированной водой до метки. Полученную смесь оставляют на 5–10 мин.

К 10 мл вытяжки добавить 100 мкл раствора крахмала (1%) в качестве индикатора. Затем полученный раствор титруют раствором йода. Точкой эквивалентности служило возникновение устойчивого синего окрашивания, сохраняющегося в течение 30 с.

Обработка результатов

Расчет содержания аскорбиновой кислоты в исследуемых объектах был произведен исходя из того, что 1 мл 0,125%-го раствора йода окисляет 0,88 мг аскорбиновой кислоты.

Расчёт содержания витамина С в 1 г продукта проводят по формуле

где A – объём раствора йода, ушедшего на титрование; 0,88 – грамм-эквива- лент аскорбиновой кислоты; B – суммарный объём вытяжки, мл; C – масса плодов, г; 10 – объём вытяжки, взятый для анализа, мл.

3.9. Колориметрическое определение аскорбиновой кислоты (по Г. Н. Чупахиной)

При количественном определении аскорбиновой кислоты в растениях широко распространенным методом титрования растительных вытяжек 2,6-дихлорфенолиндофенолом имеются некоторые трудности, связанные

32

с определением конца титрования. Синяя краска 2,6-дихлорфенолиндофе- нол восстанавливается в бесцветное соединение присутствующей в растительной вытяжке аскорбиновой кислотой (реакция Тильманса) таким образом, что на одну молекулу аскорбиновой кислоты приходится две молекулы краски. Избыток краски в кислой среде обусловливает розовое окрашивание вытяжки, однако полученное окрашивание раствора нестабильно, интенсивность его все время уменьшается до полного исчезновения, поэтому результат титрования во многом зависит от его времени.

Реактивы и материалы:

–гидроксид натрия (C = 0,01 моль/л),

–щелочной раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (C = 0,025%),

–растительный материал,

–ФЭК или спектрофотометр.

Подготовка материалов

0,025% щелочной раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола. Для приго-

товления раствора краски берут 0,0625 г 2,6-дихлорфенолиндофенола, навеску переносят в мерную колбу на 250 мл, куда приливают 150–200 мл теплой дистиллированной воды и 600 мкл 0,01 н натриевой щелочи. Колбу встряхивают в течение 10–15 мин до полного растворения краски; после того как содержимое колбы примет комнатную температуру, раствор доводят до метки водой и взбалтывают.

Построение калибровочного графика

Для построения калибровочной кривой 10 мг аскорбиновой кислоты растворяют в 100 мл 2%-й соляной кислоты. Из данного раствора готовят разведения, содержащие 1, 2, 3 мкг и т. д. аскорбиновой кислоты в 1 мл.

К 10 мл каждой пробы добавляют по 1 мл свежеприготовленного 0,025%-го раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.

Как только к пробе прилита краска, включают секундомер. Растительную вытяжку с краской хорошо перемешивают, раствор заливают в кювету толщиной 10 мм. Кювету вставляют в держатель кювет колориметра, нулевую точку которого предварительно устанавливают по 2%-й соляной кислоте. Фотометрирование ведут при 530 нм (зеленый светофильтр). Параллельно колометрируют 10 мл 2%-й соляной кислоты с 1 мл краски (контроль).

Проведение анализа

Навеску измельчают ножницами из нержавеющей стали, так как следы тяжелых металлов способствуют окислению аскорбиновой кислоты. Измельченный материал заливают 10 мл 2%-й соляной кислоты и быстро растирают. Гомогенат количественно переносят в мерную колбу на 100 мл,

33

объем доводят до метки раствором 2%-й соляной кислоты, которая является одним из лучших стабилизаторов аскорбиновой кислоты в растворе, к тому же она осаждает белки. Содержание колбы встряхивают, центрифугируют (10 000 об/мин 10 мин). Из супернатанта берут три пробы по 10 мл. К каждой пробе добавляют по 1 мл свежеприготовленного 0,025%-го раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.

Как только к пробе прилита краска, включают секундомер. Растительную вытяжку с краской хорошо перемешивают, раствор заливают в кювету толщиной 10 мм. Кювету вставляют в держатель кювет колориметра, нулевая точка которого предварительно устанавливают по 2%-й соляной кислоте. Фотометрирование ведут при 530 нм (зеленый светофильтр). Параллельно колориметрируют 10 мл 2%-й соляной кислоты с 1 мл краски (контроль).

В том случае, когда вытяжка растений содержит значительное количество аскорбиновой кислоты (около 700 мкг на 1 г), при добавлении 1 мл краски к 10 мл вытяжки краска полностью обесцвечивается аскорбиновой кислотой. В этом случае вытяжку необходимо разбавить вдвое 2%-й соляной кислотой и учесть это при расчете содержания аскорбиновой кислоты.

Обработка результатов

Содержание аскорбиновой кислоты на 1 г исследуемого материала вычисляют по формуле

где X – количество аскорбиновой кислоты, мкг; – содержание аскорбиновой кислоты в 1 мл вытяжки, найденное по калибровочной кривой, мкг; V – объем экстракта, полученного из данной навески, мл; m – навеска исследуемого материала, г.

3.10. Спектрофотометрическое определение содержания аскорбиновой кислоты

Для определения содержания аскорбиновой кислоты в продуктах возможно использование метода спектрофотометрии в ультрафиолетовом диапазоне спектра без добавления красителей. Однако данный метод отличается большой погрешностью, поскольку при 265 нм поглощается не только аскорбиновая кислота, но и некоторые другие сопутствующие соединения.

Реактивы и материалы:

–Na3PO4 (pH 7,3–7,4) (C = 0,21 моль/л),

–растительный материал,

–соляная кислота (C = 2%),

–спектрофотометр с возможностью измерения в УФ-диапазоне спектра.

34

Подготовка материалов

0,21 М Na3PO4 (pH 7,3–7,4)

3,444 г Na3PO4 растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Объём раствора доводят до 100 мл. Если рН отличается от указанной, доводят её соляной кислотой или натриевой щёлочью.

Проведение анализа

Навеску растительного материала 2 г (точный вес) гомогенизируют с 10 мл 2%-й соляной кислоты. Гомогенат переносят в мерную колбу на 50 мл.

Объем доводят до метки раствором 0,21 М Na3PO4. Экстракт центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин, экстинцию раствора измеряют на спектрофотометре при 265 нм против стандарта – раствора 0,21 М Na3PO4.

где X – содержание аскорбиновой кислоты, мкМ; 1,655 · 104 – коэффициент молярной экстинкции аскорбиновой кислоты; A265нм – оптическая плотность, определённая на спектрофотометре при 265 нм.

Содержание аскорбиновой кислоты выражают в мкг на грамм сырого веса. Молярная масса аскорбиновой кислоты равна 176 г/моль.

3.11. Фотометрическое определение каротина

Сущность метода состоит в экстракции каротина петролейным эфиром или бензином и фотометрическом измерении интенсивности окраски экстракта, которая зависит от содержания каротина.

Реактивы и материалы:

–исследуемый материал (морковь, тыква, апельсин, манго, мандарин),

–калия дихромат,

–натрий сернокислый безводный,

–окись алюминия,

–окись кальция,

–песок,

–петролейный эфир,

–фотоэлектроколориметр.

35

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1. Правила работы в химической лаборатории

1.Работать в лаборатории разрешается только в халатах.

2.Длинные волосы должны быть подобраны.

3.Все процедуры при выполнении работы можно проводить только на своем рабочем месте или в вытяжном шкафу.

4.При возникновении каких-либо неясностей работу прекратить и обратиться за разъяснением к преподавателю или лаборанту.

5.В процессе работы все флаконы с реактивами должны находиться на отведенных для них местах.

6.Необходимо соблюдать осторожность при работе с кислотами и щелочами.

7.Запрещается отмеривать реактивы путем всасывания ртом в пипетку.

8.Запрещается закрывать пальцем отверстия пробирок и колб при взбалтывании растворов.

9.При нагревании пробирки в пламени горелки следить, чтобы отверстие пробирки не было направлено на кого-либо из работающих. Во избежание выброса содержимого из пробирки нагрев производить постепенно, постоянно встряхивая ее и периодически вынимая из пламени. Во избежание ожогов и поражения от брызг и выбросов не следует наклоняться над сосудом, в который налита какая-либо жидкость.

10.Пролитый реактив немедленно удалить со стола.

11.При попадании на кожу кислоты или щелочи необходимо тотчас же пораженный участок обильно промыть водой, обработать нейтрализующими веществами: 2%-ным раствором бикарбоната натрия или 2%-ным раствором уксусной кислоты.

12.Запрещается принимать пищу в лаборатории.

13.Запрещается трогать и включать приборы без разрешения преподава-

теля.

14.После окончания работы показать преподавателю результаты эксперимента и, получив разрешение на окончание работы, привести в порядок свое рабочее место.

15.Использованную посуду освободить от содержимого, сполоснуть и сдать лаборанту.

38

Приложение 2. Правила работы на фотоэлектроколориметре

Фотоэлектроколориметр (ФЭК) предназначен для измерения экстинкции прозрачных окрашенных растворов (колориметрия), а также для измерения величины светорассеяния непрозрачных растворов и суспензий (нефелометрия). Каждый ФЭК снабжен набором светофильтров, позволяющих варьировать длину волны света, проходящего через раствор (в переделах видимой части спектра), а также комплектом стеклянных кювет с разным расстоянием между рабочими гранями для проведения измерения при разной толщине слоя раствора.

Общая схема прибора КФК-2 и обозначения: 1 – рукоятка установки светофильтра (около рукоятки маркировка по длине волны); 2 – ручка перемещения кювет в кюветном отделении; 3 – ручка включения чувствительности фотоприемников (обозначена цифрами 1, 2 и 3 черного цвета при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм и красного цвета – в диапазоне от 590 до 980 нм); 4 – микроамперметр (по верхней шкале измеряют коэффициент светопропускания (от 0 до 100%), а по нижней – оптическую плотность раствора (от 0 до 1,5); 5 – ручка «грубой» настройки микроамперметра; 6 – установка «точной» настройки микроамперметра;

7 – крышка кюветного отделения

I.Подготовка прибора к работе:

1)установить нужный светофильтр (рукояткой 1);

2)рукоятку 3 (чувствительность фотоэлемента) установить на цифру 1 соответствующего цвета: при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм чувствительность обозначена цифрами черного цвета и в диапазоне от 590 до 980 нм – красного;

3)проверить, выключен ли микроамперметр (рукоятки 5 и 6 должны быть повернуты до отказа влево);

4)прибор включить (вилку в сеть; тумблер, расположенный на задней стенке в нижнем левом углу, переключить в положение «вкл»). При этом загорается лампочка накаливания;

5)прибор прогреть в течение 15–20 мин.

39

II.Измерение оптической плотности раствора:

1)кювету с контролем или растворителем поставить в дальнее (от исследователя) гнездо кюветодержателя, кювету с исследуемым раствором (опытом) – в ближнее гнездо кюветодержателя;

2)кювету с контролем (или растворителем) поместить в световой поток поворотом ручки 2 до отказа влево;

3)закрыть крышку кюветного отделения (7);

4)установить стрелку микроамперметра на 0 по нижней шкале поворотом ручки 5 («грубой» настройки). В случае необходимости воспользоваться ручкой 6 («точной» настройки); Примечание. Если не удается вывести стрелку микроамперметра на 0, необ-

ходимо повысить чувствительность фотоэлемента. Для этого необходимо: а) микроамперметр выключить (рукоятки 5 и 6 до отказа влево); б) рукоятку переключения чувствительности фотоэлемента (3) поставить

на цифру 2 соответствующего цвета; в) вывести стрелку микроамперметра на 0 по нижней шкале (т. е. повто-

рить действия, указанные в пункте 4).

Если и в этом случае стрелка микроамперметра не выводится на 0, необходимо еще раз повысить чувствительность фотоэлемента, повторяя все действия, перечисленные в пунктах «а», «б» и «в», но установив рукоятку 3 на цифру 3 соответствующего цвета;

5)заменить в световом потоке кювету с контролем на кювету с исследуемым раствором (опытом), поворачивая рукоятку 2 до отказа вправо;

6)записать величину оптической плотности исследуемого раствора по нижней шкале микроамперметра;

7)микроамперметр выключить (рукоятки 5 и 6 до отказа влево).

III.Завершение работы на приборе:

1)реактивы из кювет вылить;

2)кюветы сполоснуть дистиллированной водой и поставить в чашку Петри вверх донышком (кюветы необходимо полоскать только после полного завершения работы или методики, в промежутках между отдельными измерениями этого делать не следует!);

3)прибор выключить (тумблер, расположенный на задней стенке в левом углу, переключить в положение «выкл.»; вилку вынуть из розетки);

4)крышку кюветного отделения закрыть.

40