Учебно-методическое пособие к большому практикуму по биохимии. В двух частях. Ч.2. Биохимия пищевых продуктов

с последующим добавлением фенола, который образует с моносахаридами окрашенные продукты, и последующим измерением оптической плотности получившегося раствора.

Реактивы и материалы:

–глюкоза или галактоза,

–раствор кальция хлористого (C = 10%),

–серная кислота концентрированная,

–фенол (C = 5%),

–ФЭК или спектрофотометр.

Построение калибровочного графика

Подготовить стандартные растворы с известной концентрацией. 1. Последовательное двукратное разведение:

200 мкг/мл – 100 мкг/мл – 50 мкг/мл – 25 мкг/мл – 12,5 мкг/мл 2. Последовательное разведение:

К 0,2 мл стандартного раствора добавляют 0,2 мл 5%-го фенола и 1 мл H2SO4конц. Пробирки оставляют на 10 мин, затем измеряют поглощение при 490 нм. Стандартную кривую строят, используя глюкозу или галактозу.

Проведение измерений

Готовят сыворотку молока осаждением белков хлористым кальцием. Вносят 5 мл исследуемого молока в пробирку на 10 мл, прибавляют 5– 6 капель 10%-го раствора CaCl2, закрывают резиновой пробкой. Пробирку помещают в водяную баню и кипятят 10 мин, затем охлаждают до комнатной температуры. Осадок белков отделяют центрифугированием 10 мин при 10 000 об/мин.

К 0,2 мл предварительно разведённого в 500 раз молока добавляют

0,2 мл 5%-го фенола, а затем 1 мл H2SO4конц и перемешивают. Пробирки оставляют на 10 мин и измеряют поглощение при 490 нм.

Оценку общего количества углеводов проводят по калибровочному графику.

11

1.8. Определение содержания лактозы рефрактометрическим методом

Рефрактометрический метод является простым, удобным и быстрым методом анализа содержания лактозы в молочной сыворотке. Он основан на способности сыворотки молока после осаждения белка преломлять луч света, проходящего через нее, на определенный угол в зависимости от концентрации углеводов.

Реактивы и материалы:

–водяная баня,

–раствор кальция хлористого (C = 10%),

–рефрактометр,

–центрифуга.

Подготовка прибора к работе

Предварительно проверяют нулевую точку прибора по дистиллированной воде (nH202O = 1,333). Для этого наносят на нижнюю призму 1– 2 капли дистиллированной воды, закрывают верхнюю призму. Луч света направляют зеркалом прибора на осветительную призму (или направляют луч осветителя на призму), устанавливают окуляр рукояткой на резкость видимости по шкале прибора и визирной линии (представляющей собой три штриха). Окуляр перемещают до совпадения визирной линии с границей светотени. При правильной установке прибора граница светотени при 20 °С должна совпадать с нулевым делением шкалы сухих веществ и делением 1,333 шкалы показателя преломления. Если нулевая линия не совпадает, проводят настройку прибора специальным ключом. После настройки прибора призмы насухо вытирают мягкой тканью.

Проведение анализа

Приготавливают сыворотку молока осаждением белков хлористым кальцием. Вносят 5 мл исследуемого молока в пробирку на 10 мл, прибавляют 5–6 капель 10%-го раствора CaCl2, закрывают резиновой пробкой. Пробирку помещают на 10 мин в водяную баню при температуре кипения, затем охлаждают до температуры 20 °С. Осадок белков отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 10 000 об/мин.

Пипеткой втягивают немного прозрачной жидкости из пробирки и наносят каплю сыворотки на нижнюю призму рефрактометра. Наблюдая в окуляр, вращением рукоятки компенсатора дисперсии устраняют расплывчатость и радужность окраски границы светотени. Передвижением окуляра добиваются полного совпадения граничной линии с визирным указателем и отсчитывают показатель преломления сыворотки по нижней

12

Раздел 2. МАСЛА И ЖИРЫ

2.1. Определение сухого вещества

Сущность методов определения массовой доли влаги и сухого вещества основана на высушивании навески исследуемого продукта при постоянной температуре.

К сухим веществам масел и жиров относятся жиры, сахара, белки, витамины, минеральные вещества. Содержание сухих веществ в маслах и жирах нормируется документами.

Реактивы и материалы:

–фарфоровая чаша для выпаривания,

–кислота соляная концентрированная,

–песок,

–сито с диаметром отверстий 1–1,5 мм,

–стеклянная палочка,

–сухожаровой шкаф.

Подготовка материалов

Песок просеивают через сито с отверстиями диаметром 1–1,5 мм и отмучивают водопроводной водой. Затем приливают соляной кислоты, разведённой в 2 раза, столько, чтобы песок был полностью покрыт ею, перемешивают стеклянной палочкой, дают отстояться в течение 20 мин. Слив соляную кислоту, ещё раз приливают соляной кислоты, разведённой в 2 раза, столько, чтобы песок был полностью покрыт ею, перемешивают стеклянной палочкой, дают отстояться в течение 20 мин. После этого кислоту сливают, промывают песок водопроводной водой до нейтральной реакции (по индикаторной бумаге), промывают однократно дистиллированной водой, высушивают и прокаливают в сушильном шкафу при температуре 102 ± 2 °С в течение 2 ч. Хранят песок в банке с плотно закрытой пробкой.

Проведение анализа

Фарфоровую чашу с 5–10 г хорошо промытого и прокаленного песка взвешивают, записывая результат до 4-го знака после запятой (m0). В эту же чашу пипеткой вносят 1 мл исследуемого объекта и немедленно взвешивают, записывая результат до 4-го знака после запятой (m).

14

Затем содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой и чашу помещают в сушильный шкаф с температурой 102±2 °С. По истечении 2 ч чашу вынимают из сушильного шкафа, охлаждают и взвешивают. Далее чашу снова убирают в сушильный шкаф с температурой 102±2 °С на 30 мин, после этого вынимают, охлаждают и взвешивают. Взвешивание производят до тех пор, пока разность между двумя последовательными взвешиваниями будет равна или менее 0,01 г (m1).

Обработка результатов

Массовую долю сухого вещества C, %, вычисляют по формуле

где m0 – масса чаши с песком и стеклянной палочкой, г; m – масса чаши с песком, стеклянной палочкой и навеской исследуемого продукта до высушивания, г; m1 – масса чаши с песком, стеклянной палочкой и навеской исследуемого продукта после высушивания, г.

2.2. Определение кислотного числа

Кислотное число (КЧ) – это количество мг КОН, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира. Кислотное число зависит от качества жира, способа его получения, условий его хранения и других факторов. Кислотное число относится к регламентированным ГОСТом показателям.

Реактивы и материалы:

–гидроксид калия, спиртовой раствор (C = 0,1 моль/л),

–образцы жиров и масел (подсолнечное масло, сливочное масло, маргарин, оливковое масло, рапсовое масло),

–раствор фенолфталеина спиртовой (C = 1%),

–этиловый спирт (96%).

Проведение анализа

В конической колбе взвешивают 1–2 г образца жира с погрешностью не более 0,01 г, приливают отмеренные цилиндром 10 мл 96%-го этилового спирта, перемешивают до растворения навески образца и добавляют несколько капель раствора фенолфталеина. Полученный раствор при постоянном перемешивании титруют из микробюретки спиртовым раствором КОН до слабо-розовой окраски, устойчивой в течение 30 с.

15

мл 0,1 моль/дм3 раствора КОН, затраченное на титрование; m – навеска образца масла, г.

Пользуясь коэффициентом пересчёта на олеиновую кислоту (для подсолнечного, соевого масла и кондитерского жира) и пальмитиновую кислоту (для пальмового масла), равным 0,503 и 0,456 соответственно, определяют примерное содержание свободных жирных кислот в % в исследуемых образцах жиров.

2.3. Определение перекисного числа

Перекисное число (ПЧ) выражают в миллимолях активного кислорода на 1000 г жира или процентах йода, выделившегося при взаимодействии активного пероксидного или гидропероксидного кислорода c йодистоводородной кислотой.

Метод основан на реакции взаимодействия активного пероксидного или гидропероксидного кислорода с йодистоводородной кислотой при титровании.

OH

Выделившийся свободный йод оттитровывают тиосульфатом натрия:

I2 + 2Na2S2O3 = 2NaI + Na4S4O6.

Метод предназначен для определения первичных продуктов окисления жиров и масел – пероксидных и гидропероксидных соединений.

16

Реактивы и материалы:

–хлороформ, х. ч.,

–ледяная уксусная кислота,

–свежеприготовленный водный раствор йодистого калия (C = 50%),

–раствор тиосульфата натрия (C = 0,01 моль/л),

–раствор крахмала (C = 1%).

Проведение анализа

В коническую колбу с пришлифованной крышкой взвешивают с точностью до третьего десятичного знака 1 г исследуемого масла (жира). Навеску масла (жира) растворяют в 10 мл предварительно приготовленной смеси ледяной уксусной кислоты и хлороформа (в соотношении 2 : 1 по объёму). Добавляют в колбу 1 мл 50%-го раствора KI. Колбу выдерживают 20 мин без доступа света. Затем в колбу добавляют 50 мл дистиллированной воды и 5–6 капель 1%-го раствора крахмального клейстера. Выделившийся йод титруют 0,01 моль/л раствором тиосульфата натрия. Параллельно с основным определением проводят контрольное определение.

где V1 – количество 0,01 моль/л раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование в основном опыте, мл; V2 – количество 0,01 моль/л раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование в контрольном опыте, мл; C – концентрация раствора тиосульфата натрия, моль/л; m – масса исследуемого образца масла или жира, г; 1000 – коэффициент, учитывающий пересчёт результата измерения в мМ на кг.

2.4. Определение йодного числа жира

Метод основан на способности непредельных жирных кислот присоединять йод. Для характеристики степени непредельности жирных кислот молочного жира используют йодное число. Количественное йодное число выражается в граммах йода, присоединяющегося к 100 граммам жира. По мере хранения жира количество непредельных жирных кислот понижается благодаря их высокой реакционной способности. Это приводит к уменьшению значения йодного числа и может служить косвенной характеристикой степени свежести жира.

Реакции, характеризующие процесс, описывается следующим уравнением:

I2 + HOH → HI + HOI.

17

В обычных условиях йод практически не реагирует с водой, но в присутствии веществ, поглощающих йодноватистую кислоту, равновесие реакции сдвигается вправо:

Избыток йода оттитровывают тиосульфатом натрия:

I2 + 2Na2S2O3 → 2NaI + Na2S4O6.

Реактивы и материалы:

–колба коническая с притертой пробкой вместимостью 400 мл,

–водяная баня,

–секундомер,

–шейкер,

–раствор йода спиртовой (C = 0,2 моль/л),

–раствор крахмала (C = 1%),

–раствор тиосульфата натрия (C = 0,1 моль/л).

Проведение анализа

Берут две конические колбы вместимостью по 250 мл с притертыми пробками. В одну отвешивают 0,10 ±0,01 г расплавленного жира (опытная проба), другую оставляют пустой (контрольная проба). В обе колбы из бюретки добавляют по 8 мл 96%-го этанола. Опытную пробу нагревают на водяной бане с температурой 50–60 °C до получения однородной эмульсии.

Затем в обе колбы из бюретки вносят по 10 мл спиртового раствора йода (C = 0,2 моль/л) и цилиндром – по 80 мл дистиллированной воды. Содержимое перемешивают. Колбы закрывают пробками и выдерживают при комнатной температуре в темном месте в течение 15 мин.

Далее реакционную смесь в каждой колбе быстро (чтобы максимально связать избыток йода) титруют из бюретки раствором тиосульфата натрия (C = 0,1 моль/л) до желтого окрашивания, после чего добавляют

18

0,5 мл 1%-го раствора крахмала. Смесь приобретает буро-фиолетовую окраску. Содержимое колбы вновь титруют раствором тиосульфата натрия, добавляя его по каплям до обесцвечивания.

В расчете используют весь объем раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование каждой пробы.

где K – йодное число, ед. (1 ед. соответствует 1 г йода, присоединяющегося к 100 г жира); Vk – объем раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование контрольной пробы, мл; Vo – объем раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование опытной пробы, мл; 0,01269 – масса йода, соответствующая 1 мл раствора тиосульфата натрия с эквивалентной концентрацией 0,1 моль/л, г; m – масса жира, г; 100 – коэффициент пересчета на 100 г жира.

2.5. Определение числа омыления молочного жира

Метод основан на способности жира омыляться гидроксидом калия. Число омыления косвенно характеризует среднюю молекулярную массу смеси жирных кислот: чем больше в жире содержится низкомо-

лекулярных кислот, тем выше число омыления.

Пониженное значение этой константы может служить признаком фальсификации молочного жира другими жирами. Количественно число омыления выражается массой гидроксида калия (мг), необходимого для полного омыления 1 г жира.

Реактивы и материалы:

–водяная баня для колбы,

–бюретки вместимость 50 мл и ценой деления 0,1 мл,

–гидроксида калия спиртовой раствор (C = 0,5 моль/л),

–колба коническая вместимостью 250 мл,

–раствор фенолфталеина спиртовой (C = 1%),

–соляная кислота (C = 0,5 моль/л).

Проведение анализа

Берут две конические колбы вместимостью по 250 мл. В одну отвешивают 1,0–2,0 ±0,1 г расплавленного и профильтрованного жира (опытная проба), другую оставляют пустой (контрольная проба). В обе колбы

19