Основы общей микробиологии и иммунологии. Учебное пособие

АНТИМИКРОБНЫЕ ПРЕПАРАТЫ. АНТИБИОТИКИ

Открытие в 1929 году антибиотиков Александром Флемингом ознаменовало начало новой эры в лечении болезней, вызываемых микроорганизмами.

Антибиотики – это вещества природного происхождения, а также их полусинтетические производные и синтетические аналоги, оказывающие избирательное повреждающее или губительное действие на микроорганизмы и некоторые опухоли.

Их называют также антимикробными препаратами

(АМП).

Антибиотики классифицируют:

по происхождению и различают:

-природные: полученные из бактерий (грамицидин, полимиксин и др.), грибов (пенициллин, циклоспорины и др.), актиномицетов (стрептомицин, тетрациклин и др.), простейших(круцин) и др., полученные из низших (усниновая кислота) или высших (фитонциды) растений, полученные от теплокровных (лизоцим, эритрин), холоднокровных (экмолин) животных, от насекомых (иридомирмецин).

-по химической структуре: бета-лактамные, тетра-

циклины, аминогликозиды, макролиды, полипептиды, полиеновые, рифамицины, а также входящие в дополнительную группу (левомицетин, линкомицин, гризеофульвин).

-по механизму действия. Под механизмом действия понимают те структуры или компоненты клетки (мишени), на которые направлено действие препарата. Так, пенициллины нарушают синтез клеточной стенки, полимиксиныцитоплазматической мембраны, тетрациклины - синтез белков и т.д.

– по спектру действия антибиотики подразделяют на:

• антибактериальные - эффективные при действии на бактерии. Среди них выделяют антибиотики широкого

41

спектра действия, активные по отношению ко многим грамположительным и грамотрицательным бактериям и узкого спектра действия, избирательно подавляющие определенные группы бактерий (грамположительные, грамотрицательные, туберкулезные).

•противогрибковые (антифунгальные). Действуют на грибы. Среди них также есть препараты широкого и узкого спектра,

•антипротозойные - ингибируют рост простейших,

•противоопухолевые – обладают цитотоксическим действием и применяются в онкологии,

•противовирусные – используются для борьбы с ви-

русами.

Антибиотики оказывают на микроорганизмы бактериостатическое или бактерицидное действие. В первом случае микробы приостанавливают рост и размножение, а во втором–погибают. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяют различными методами. Наиболее распространенные – метод серийных разведений и метод дисков.

Метод серийных разведений. Готовят основной рас-

твор препарата, содержащий определенное количество единиц действия – ЕД (для большинства антибиотиков 1 ЕД=1 мкг химически чистого вещества). Берут ряд пробирок и на-

ливают в них по 1 мл стерильного бульона (МПБ). В первую пробирку вносят 1 мл исходного раствора препарата и готовят разведения, перенося в каждую следующую пробирку по 1 мл из предыдущей. Затем в каждую пробирку с разведением антибиотика вносят одинаковое количество испытуемой тест-культуры микроорганизма. Контролем служат 2 пробирки. В одной из них МПБ +микроорганизм, в другой – МПБ + антибиотик. После инкубирования в термостате в течение 24ч при 37ºС учитывают результаты. Минимальная концентрация препарата, при которой подавляется размно-

42

жение микроорганизма (среда прозрачна) считается бакте-

риостатической дозой или минимальной подавляющей кон-

центрацией – МПК. Бактерицидные дозы определяют при высеве из тех пробирок с разведениями антибиотика, в которых не было видимого роста. На плотной среде не должны вырастать колонии.

Метод бумажных дисков (диско-диффузионный метод). Исследуемую культуру микроорганизма шпателем засевают газоном на чашку Петри. На поверхность посева на расстоянии друг от друга накладывают бумажные диски одинакового размера, пропитанные различными антибиотиками. Чашки помещают в термостат на 16-24ч, учитывают результаты, измеряя диаметр зон отсутствия роста, которые образуются вокруг дисков с препаратами и делают заключение об активности препарата. Диаметр менее 10 мм указывает на отсутствие активности, 10-15 мм - на слабую активность; 20-25 мм и более – на высокую активность.

Осложнения при антибиотикотерапии. Следует помнить о том, что антибиотики оказывают действие и на макроорганизм, которые могут проявляться в виде опасных и неопасных для жизни пациента реакциях. Опасными считаются анафилактический шок, отек гортани. Не опасными - зуд, аллергия, риниты и др. У лиц, принимающих антибактериальные антибиотики широкого спектра действия, когда погибает не только возбудитель заболевания, но и бактериальная нормофлора, могут возникнуть дисбиозы и дисбактериозы. Чаще всего это кандидамикозы. Среди осложнений встречаются также токсические реакции, обусловленные дозами препарата, состоянием больного и способами введения антибиотика. Токсические реакции могут привести к поражению печени, почек, слухового нерва и др. Ряд препаратов оказывает иммунодепрессивное действие, подавляя антителообразование, что приводит к снижению иммунитета и может вызвать рецидивы или реинфекции при некоторых инфекционных заболеваниях. Лечение ударными дозами анти-

43

биотиков, вызывающее массовую гибель микробов, приводит к тому, что в организм выделяется большое количество эндотоксинов и продуктов метаболизма и в первые часы после начала лечения наблюдается временное резкое ухудшение состояния больного (феномен Герц - Гейнера ).

Механизмы формирования антибиотикорезистен-

ции у бактерий. Устойчивость к антибиотикам может быть природной (для нее характерно отсутствие мишени, на которую направлено действие препарата) и приобретенной. Примером природной резистентности могут служить микоплазмы, на которые не действует пенициллин и другие ингибиторы синтеза клеточной стенки, так как она отсутствует у данного микроорганизма. Приобретенная устойчивость обусловлена мутационно-рекомбинационными изменениями генного аппарата микроорганизма. Большую роль в формировании приобретенной лекарственной устойчивости играют R-плазмиды (плазмиды резистентности), кодирующие устойчивость к одному или нескольким антимикробным препаратам. Приобретенная устойчивость может проявляться как:

–модификация мишени – в результате различных воздействий на микроорганизм могут появиться мутанты с измененной структурой отдельных органелл клетки и на такие “новые мишени” антибиотик подействовать уже не может;

–инактивация антибиотика. Некоторые микроор-

ганизмы способны продуцировать ферменты, разрушающие антибиотик. Например, до 60-80 % стафилококков образуют β-лактамазы (пецициллиназы), повреждающие беталактамное кольцо пенициллина. Амидазы инактивируют цефалоспорины и т.д.;

–активное выведение антибиотика из микробной клетки. (эффлюкс). У некоторых микроорганизмов есть специальные транспортные системы, которые кодируются определенными генами. Так, у синегнойной палочки, пнев-

44

мококка вывод из клетки ряда макролидных антибиотиков регулируется геном mef. В результате концентрация препарата понижается и он не представляет опасности для бактерии.

–нарушение проницаемости внешних структур мик-

робной клетки. В результате мутаций некоторые штаммы микробов утрачивают способность образовывать белкипорины, в результате чего клетка теряет проницаемость, но зато приобретает устойчивость к антибиотику, перед которым как бы “закрывают двери”.

–формирование «метаболического шунта». Иногда микроорганизмы приобретают гены, изменяющие определенные этапы метаболического пути клетки и направляют его по «обходному пути», на котором антибиотик не может ингибировать метаболизм клетки.

Антибиотикорезистентные микроорганизмы представляют огромную опасность для здоровья и проблема лекарственной устойчивости имеет большое социальноэкономическое значение. Для преодоления антибиотикоре- зистентности рекомендуется:

–сократить использование антибиотиков с профилактической целью;

–периодически менять набор препаратов, применяемых для лечения в пределах одного лечебного учреждения;

–увеличивать дозы антибиотиков в допустимых пределах, чтобы не вызвать отрицательного воздействия на макроорганизм и по возможности вводить препарат непосредственно в очаг поражения (внутриплеврально, внутрь сустава

ит.п.);

–пролонгировать действие препарата путем иммобилизации его на носителях, например на полимерных соединениях;

–использовать по возможности антибиотики вместе с другими препаратами, сочетание с которыми позволяет пре-

45

одолеть антибиотикорезистентность. Например: клавулановая кислота ингибирует бета-лактамазы;

– ограничить применение в ветеринарии антибиотиков, используемых в медицинской практике. Это относится и к использованию антибиотиков в пищевой промышленности.

Принципы получения антибиотиков. Антибиотики получают методами биологического синтеза, химического синтеза и комбинированным способом. В первом случае штамм-продуцент выделяют из окружающей среды, проверяют его антагонистические свойства по отношению стандартного набора тест-организмов, подбирают условия культивирования продуцента, выделения и очистки синтезируе-

мого им антибиотика.

Химический синтез предусматривает получение биологически активных препаратов в результате различных реакций с химическими реагентами. Таким способом был получен левомицетин.

Комбинированный способ объединяет два предыдущих. Полусинтетические антибиотики получают путем введения химических элементов или соединений на определенных этапах культивирования природных продуцентов. Эти вещества встраиваются в молекулу будущего антибиотика и изменяют структуру и свойства препарата.

БАКТЕРИОФАГИ

Бактериофаги (фаги) – вирусы бактерий, открытые в 1917 году канадским ученым Ф.д´Эррелем. Они, как и все вирусы, являются строгими внутриклеточными паразитами и не растут на питательных средах. Выделяют две формы су-

ществования фагов: элементарную фаговую частицу, пред-

ставляющую собой внеклеточную, покоящуюся форму и ве-

46

гетативную, внутриклеточную, представленную только нуклеиновой кислотой.

Строение бактериофага. Элементарная фаговая частица в большинстве случаев имеет форму головастика (сперматозоидная форма). Она состоит из головки и хвостового отростка. Головка представляет собой нуклеиновую кислоту, окруженную белковой оболочкой (капсидом). Все вирусы содержат только одну нуклеиновую кислоту –ДНК или РНК.Отросток устроен сложнее. В нем есть полый стержень, окруженный сократительным белковым чехлом. Стержень заканчивается пластиной с шипами и отходящими от них нитями (антеннами) или ворсинками, с помощью которых фаг прикрепляется к бактериальной клетке. Базальная пластина и шипы некоторых фагов содержат лизоцим. Фаги отличаются по форме и размерам. Есть фаги с несокращающимся хвостовым отростком. Известны фаги, не имеющие такого отростка. Различают 5 морфологических типов фагов. У 1,2 и 3 типа – ДНК двунитчатая, у 4 типа однонитчатая ДНК или РНК и у 5 –однонитчатая РНК. По форме фаги бывают нитевидными, сферическими, сложной кубической симметрии.

Бактериофаги достаточно устойчивы к действию температуры и сохраняют жизнеспособность как при нагреве до 60-65ºС и даже 70ºС , так и при замораживании до – 185ºС. Они длительно выживают при высушивании, воздействии 0,5% раствора сулемы, 1% раствора фенола и растворов щелочей. А вот растворы кислот, 1% формалина, ультрафиолетовые лучи, ионизирующая радиация убивают фаги через несколько минут.

Взаимодействие фага с клеткой. Фаги размножают-

ся (репродуцируются) внутри клеткихозяина. Такими клетками являются бактерии разных видов, грибы. При этом фаги обладают высочайшей степенью специфичности по отношению к хозяину. Эта специфичность проявляется в том, что они способны лизировать бактерии близкородственных

47

видов (поливалентные фаги), строго определенного вида (видовые фаги), а некоторые - только отдельные штаммы внутри вида (типовые фаги). Процесс воспроизведения фагов состоит из нескольких этапов:

–стадия адсорбции. Фаг адсорбируется на клеточной стенке микроорганизма, где имеются специфические рецепторы. Нити отростка фага прикрепляются к таким рецепторам. Процесс адсорбции высоко специфичен и зависит от расположения и химического состава рецепторов,

–проникновение фага в клетку. После адсорбции фага происходит сокращение чехла хвостового отростка, его стержень продвигается через клеточную стенку бактерии и разрушает ее с помощью фермента лизоцима. Затем сокращаются белки головки фага и в клетку инъецируется фаговая нуклеиновая кислота. Белки оболочки фага остаются снаружи клетки,

–образование внутри клетки новых фаговых частиц.

Фаговый геном в зависимости от строения нуклеиновой кислоты взаимодействует с различными участками клеточной ДНК при участии специального белка, который называют “белком-лоцманом”. Как и у всех вирусов, процесс воспроизведения фаговых частиц в клетке имеет дисъюнктивный (разобщенный) характер. Отдельно синтезируются нуклеиновая кислота фага, капсид и отросток, которые на заключительном этапе собираются в новую частицу фага,

–разрушение бактериальной клетки и выход зрелых фагов. Процесс образования новых фаговых частиц занимает время от нескольких минут до нескольких часов и заверша-

ется разрушением клетки и выходом образовавшихся фагов. Такие фаги называются вирулентными, а их жизненный цикл- продуктивной инфекцией. При абортивной инфекции

взаимодействие фага с клеткой прерывается на любой стадии и фаг погибает. Разрушение клеток проявляется на жидких средах просветлением бульона, а на плотных – появлением “стерильных пятен” – в виде прозрачных зон отсутствия рос-

48

та микроорганизма. Количество вновь образовавшихся фагов составляет от нескольких десятков до нескольких сотен.

Существуют фаги, взаимодействующие с клеткой подругому. После проникновения в бактерию, ДНК фага встраивается в хромосому бактериальной клетки и сосуществует с ней долгое время, не вызывая гибели. Такие фаги называют умеренными, а нуклеиновую кислоту фага, ассоциированную с бактериальной хромосомой,- профагом.

Бактериальные клетки, содержащие профаг, называют лизогенными, а сам процесс сосуществования генома фага и бактерии - лизогенией. Состояние лизогении передается по наследству. Изменение свойств клетки под действием генов, находящихся в геноме умеренного бактериофага, называется фаговой конверсией. Под действием различных факторов профаг может выходить из хромосомы клетки и вызывать ее лизис.

Практическое применение бактериофагов. Бакте-

риофаги применяют: - в целях диагностики для определения вида микроорганизма, фаготипирования выделенной бактерии с целью определения источника инфекции; - в целях выделения специфического бактериофага из исследуемого материала, выявления бактериальной загрязненности объектов внешней среды путем обнаружения в них соответствующих фагов.

Для профилактики заболеваний среди лиц, имевших контакт с больными или с инфицированным материалом в эпидемических очагах также используют бактериофаг.

Фаги применяют с лечебной целью, внедряя их в организм различными способами – перорально, введением в

полость, нанесением на пораженную поверхность. Бактериофаги нашли также применение в генной ин-

женерии.

49

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Способность к самовоспроизведению живых организмов с сохранением специфических свойств родительских особей на протяжении ряда поколений называется наследственностью. Ее материальной основой являются ДНК и РНК бактериальной клетки. У бактерий обычно находится только одна замкнутая в кольцо, а иногда линейная (например у боррелий) молекула ДНК.

У некоторых бактерий обнаруживают также внехромосомные стабильно наследуемые молекулы ДНК - плазмиды. Приобретение плазмид сопровождается появлением новых свойств, которые обеспечивают клетке лучшую адаптацию к условиям существования. Утрата клеткой плазмид не нарушает ее жизнеспособности.

Известны следующие плазмиды:

– F-плазмида ( от англ. fertilityплодовитость) - контролирует синтез F-пилей (секс-пилей), способность быть донором при конъюгации и переносить гены хромосомы от донора к реципиенту. Она может находиться в клетке в автономном состоянии (F+ штамм) или встраиваться в хро-

мосому клетки - Hfr-штамм (от англ. high frequency of recombination – высокая частота рекомбинации).

–R-плазмида (от англ. resistance – устойчивость) детерминирует устойчивость к антибиотикам, сульфаниламидам и другим антибактериальным препаратам, солям тяжелых металлов (ртути, никелю и др.). В одной плазмиде может быть несколько (3-10) детерминант резистентности. В этом случае бактерии приобретают множественную лекарственную устойчивость.

–Colплазмида обеспечивает микроорганизмам способность к синтезу бактерицинов – белковых продуктов, вызывающих гибель особей гомологичного или близкородственного вида. В зависимости от бактерий –продуцентов вы-

50