Основы общей микробиологии и иммунологии. Учебное пособие

на поверхности которого имеются антигены известного микроба, смешивают в равных количествах с сывороткой больного в разных разведениях. При положительной реакции наблюдается пассивная агглютинация в виде рыхло склеенных эритроцитов («перевернутые зонтики»). Аналогичным образом проводятся исследования на выявление и идентификацию антигенов бактерий с использованием антительного эритроцитарного диагностикума.

Реакции коагглютинации и латексагглютинации

проводят аналогичным образом. Отличия касаются лишь методик приготовления диагностикумов. В реакции коагглютинации используют антительный диагностикум. Его готовят из клеток стафилококков (штамм Cowan), к поверхностному белку А которых присоеденены молекулы антител через фрагмент Fc IgG.

При получении латексных диагностикумов используют химическое связывание белковых молекул (антител или антигенов) с полимерными микрокапсулами. Латексные частицы могут быть окрашены в различный цвет и при положительных результатах реакции хорошо виден яркий осадок.

Реакции, основанные на использовании меченных антител или антигенов.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) использует-

ся как метод экспресс-диагностики для выявления антигена в исследуемом материале от больных. Метод состоит в обработке фиксированного на стекле материала, содержащего антиген, гомологичной иммунной сывороткой, соединенной с флюорохромом. Учет результатов проводят в люминесцентном микроскопе (ЛЮМе). В положительных случаях по периферии объекта появляется светящаяся кайма зеленого цвета.

101

Недостатком метода является необходимость получения большого количества стандартных люминисцирующих сывороток против различных микроорганизмов.

Реакция непрямой флюоресценции (РНИФ) основана на применении антиглобулиновой (антивидовой) сыворотки, меченной флюорохромом. Она ставится в два этапа. На первом этапе фиксированный антиген обрабатывают обычной иммунной сывороткой. На втором этапе к прореагировавшему иммунному комплексу добавляют люминесцирующую сыворотку против глобулинов того вида животного, сыворотка которого была применена на первом этапе. Результат учитывают, как и при РИФ.

Иммуноферментный анализ (ИФА) - иммунологи-

ческая реакция специфического взаимодействия антигена и антитела, в которой в качестве индикатора используются молекулы фермента (пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и др.). При расщеплении ферментом субстрата ( ортофенилендиамина или паранитрофенилфосфат) происходит изменение цвета реактивной среды. Эти ферменты обладают уникальным свойством модифицировать одновременно большое количество молекул субстрата, что приводит к усилению чувствительности иммунологической реакции. Маркерным ферментом могут быть помечены антимикробные или антивидовые антитела, что предполагает использование разных методик проведения анализа: твердофазный ИФА, сэндвич-метод ИФА и др. Компоненты иммунного комплекса выявляются с помощью фотометра или специального ри-

дера типа «Multiscan » и др.

Иммунопрофилактика инфекционных болезней

Научные основы иммунопрофилактики были заложены Л.Пастером. В результате своих опытов Пастер пришел к заключению о возможности предупреждения инфекционных заболеваний путем предварительных прививок маловиру-

102

лентных культур микроорганизмов. Он разработал методы ослабления (аттенуации) вирулентных бактерий и получения вакцинных штаммов.

Вакцины – профилактические биопрепараты, приготовленные из микробов или их антигенов. На введение вакцины организм отвечает формированием искусственного активного иммунитета, обусловленного выработкой антител или примированных лимфоцитов. Способы приготовления вакцин разнообразны. Общие требования, которым должны удовлетворять вакцинные препараты:

•высокая иммуногенность и способность индуцировать активный и продолжительный иммунитет;

•полная безвредность для человека;

•низкая реактогенность;

•стабильность при хранении.

По способу приготовления выделяют следующие типы вакцин:

•живые вакцины, приготовленные из живых аттенуированных (ослабленных) штаммов микроорганизмов;

•убитые вакцины, которые содержат инактивированные разными способами микроорганизмы;

•химические вакцины из высокоочищенных анти-

генов;

•вакцины, сконструированные на основе методов биотехнологии: синтетические вакцины на основе олигопептидов и олигосахаридов; генно-инженерные вакцины на основе продуктов синтеза рекомбинантных систем, ДНКвакцины.

Живые вакцины являются высокоэффективными профилактическими препаратами. Вакцинные штаммы способны размножаться в организме человека (приживаться), приводя к развитию бессимптомной или слабо выраженной инфекции (вакцинальная инфекция), которая, однако, нико-

103

гда не приобретает характер типичного заболевания для данного микроба, но формирует иммунитет.

Штаммы для приготовления живых вакцин могут быть получены различными путями:

•дженнеровским методом подбора генетически близких видов. Эти вакцины получили название дивергентных. Таким путем были получены оспенная вакцина и др.;

•пастеровским методом отбора мутантов с ослабленной вирулентностью, которые возникают под воздействием необычных для микроба условий культивирования, антител, антибиотиков, в результате пассирования через организм животных и др. Такими путями были получены вакцины для профилактики туберкулеза (вакцина БЦЖ), чумы, туляремии, сибирской язвы, бруцеллеза, Ку-лихорадки и др. Пастер, путем длительного пассирования через мозг кролика вируса уличного бешенства (133 пассажа), выделенного от больной коровы, получил фиксированный вирус (virus fixe), который применяется при изготовлении антирабической вакцины;

•методом генетической инженерии, встраивая в геном (ДНК) вакцинного штамма ген чужеродного антигена.

Такие препараты называют векторными рекомбинантными вакцинами. Примером вакцины этого типа является оспенная вакцина, в которую введен ген, кодирующий антиген HBs гепатита В.

Живые вакцины обладают рядом преимуществ перед вакцинами других типов: они обеспечивают высокую напряженность, прочность и длительность иммунитета (от 1 года до 7 лет); их вводят в организм однократно и простыми методами – через рот, через верхние дыхательные пути, накожно, подкожно.

Убитые вакцины готовят из инактивированных высоковирулентных и высокоиимуногенных штаммов микроорганизмов. Их называют так же корпускулярными, т.к. они

104

содержат целые убитые бактериальные клетки или вирионы. Для инактивации применяют способы, которые незначительно изменяют их антигенную структуру: нагревание при температуре 56-58°С в течение 1 часа, добавление формалина, фенола, ацетона, спирта, облучением ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком и др. Эффективность убитых вакцин ниже, чем живых. Их вводят обычно подкожно 2-3-раза с интервалом в 10 дней с последующей ревакцинацией через 1неделю – 3 года. Убитые вакцины применяют для профилактики брюшного тифа, коклюша, лептоспироза и др.

Аутовакцины – это вакцины из убитых бактерий, выделенных от конкретного больного. Они используются в лечебных целях. Их терапевтический эффект обусловлен дополнительной стимуляцией иммунной системы. Хороший результат таких вакцин отмечен при заболеваниях кожи кокковой этиологии (при хроническом фурункулезе, пиодермиях и др.)

Субклеточные и субвирионные вакцины (химические)

готовят из наиболее активных антигенных компонентов микробных клеток (протективные антигены).

К субклеточным вакцинам относятся менингококковые и пневмококковые вакцины, приготовленные из высокоочищенных полисахаридных антигенов капсул, для профилактики брюшного тифа (на основе Vi-антигена) и др. Субвирионной является гриппозная вакцина, содержащая гемагглютинин и нейраминидазу.

В зависимости от количества антигенов готовят мо- но-, ди-, три-, тетраили поливакцины. Используют комбинированные (из нескольких различных бактерий) и ассоциированные вакцины, состоящие из убитых бактерий и анатоксинов, сорбированных на адъювантах (веществах, которые при соединении с антигеном образуют депо и усиливают иммунный ответ). Например, химическая сорбированная ти- фо-паратифозно-столбнячная вакцина, АКДС – адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина.

105

ДНК–вакцины – особая группа вакцинных препаратов, находящихся на стадии экспериментального исследования. Использование ДНК для индукции иммунитета является по определению ВОЗ «иммунизацией нуклеиновыми кислотами». ДНКвакцины состоят из рекомбинантных ДНК плазмид, содержащих последовательности нуклеотидов, кодирующих белки-антигены бактерий, вирусов или опухолевых клеток. Плазмиду встраивают в E. сoli, где она копируется, затем ее очищают. В водном растворе плазмидные ДНК вводятся в макроорганизм разными способами (внутримышечно, внутривенно, подкожно и пр.). Они проникают в клетки (наподобие вирусов) и, используя клеточные ферменты, синтезируют белки-антигены, на которые организм развивает гуморальный и клеточный иммунный ответ. При этом ДНКвакцина обеспечивает формирование специфических лимфоцитов памяти.

К настоящему времени проведены экспериментальные исследования по применению плазмидных вакцин при гриппе, бешенстве, лихорадке Эбола, гепатите В, герпесвирусной инфекции и др. Они продемонстрировали широкие возможности ДНК-иммунизации в отношении индукции иммунитета у млекопитающих и птиц.

Анатоксины (an – отрицание, toxo –отравляю) – препараты, которые получают из бактериальных экзотоксинов. Они полностью лишены токсических свойств, но сохраняют иммуногенность. При введении в организм индуцируют выработку иммуноглобулинов – антитоксинов. Метод получения анатоксина предложил французский ученый Рамон. Для получения анатоксина в фильтрат питательного бульона, в котором выращивали бактерии-продуценты экзотоксина, добавляют 0,3 - 0,4% раствор формалина и выдерживают 3-4 недели в термостате при 37 – 40°С. Анатоксины готовят в виде препаратов, адсорбированных на адъювантах, и часто включают в состав ассоциированных вакцин. Анатоксины

106

применяют для профилактики дифтерии, столбняка, стафилококковой инфекции и др.

Генно-инженерные вакцины получают с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Принцип создания таких вакцин состоит в возможности выделения гена, кодирующего протективные антигены микроорганизма, и встраивания его в геном вирусов, бактерий или эукариотных клеток. При размножении таких клеток, наряду с собственными антигенами, нарабатываются антигены, необходимые для получения вакцины. Преимуществом таких вакцин является возможность получения только тех антигенов, которые необходимы для индукции иммунитета. Они не содержат балластных веществ, не содержат токсических неконторолируемых примесей. В настоящее время разработаны два вида генноинженерных вакцин – субъединичные и живые. Первым ген- но-инженерным препаратом, разрешенным к практическому применению, стала субъединичная вакцина на основе HBsантигена для профилактики гепатита В.

Иммунотерапия инфекционных болезней

Основой иммунотерапии инфекционных болезней является возможность быстро создать защиту путем введения в

организм специфических иммуноглобулинов (готовых антител). Впервые иммунную сыворотку для лечения использовал немецкий ученый Э.Беринг.

В зависимости от источника получения различают гетерологичные (от животных) иммунные сыворотки и гомологичные (от человека) иммуноглобулины.

Гетерологичные иммунные сыворотки готовят путем гипериммунизации животных (лошадей, ослов, волов и др.) анатоксином или другими антигенами микроорганизмов по специальным схемам. Затем из полученных от животных нативных сывороток выделяют фракции глобулинов (главным

107

образом гамма и бетта-глобулины), содержащие антитела. Эти фракции очищают от балластных белков различными методами, например обработкой протеолитическими ферментами и диализом (метод диаферм) с целью уменьшения возможных побочных реакций.

Введение иммунных сывороток формирует немедленный пассивный иммунитет, продолжительность которого 2- 4 недели. Это позволяет использовать их для экстренной профилактики и лечения инфекционных болезней.

По направленности действия такие гетерологичные лечебно-профилактические сыворотки делят на :

•антитоксические сыворотки, которые использу-

ются при токсикоинфекциях, так как они способны нейтрализовать действие соответствующих токсинов. Например, сыворотки против экзотоксинов возбудителей дифтерии, столбняка, ботулизма, холеры и др. Силу антитоксических сывороток измеряют в междунароных единицах (МЕ), соответствующих минимальному количеству сыворотки, способному нейтрализовать стандартую единицу (дозу) токсина;

•антибактериальные сыворотки, действующим на-

чалом которых является комплекс антител – агглютининов, бактериолизинов и опсонинов. Они способствуют фагоцитозу и лизису микробных клеток в организме. Однако эти сыворотки обладают малой эффективностью и способны вызывать тяжелые осложнения. В настоящее время в связи с широким использованием высокоэффективных химиопрепаратов и антибиотиков они применяются редко. В практике используют противосибиреязвенный, противолептоспирозный, противостафилококковый иммуноглобулин и др.;

•антивирусные сыворотки, которые способны инак-

тивировать вирусы. Их используют для лечения и профилактики тяжелых вирусных инфекций: клещевого энцефалита, бешенства, кори, гриппа, гепатитов и др.

108

Иммуноглобулины, получаемые из крови животных, являются гетерогенными. Введение в организм таких сывороток может сопровождаться развитием угрожаемых жизни реакций (анафилактический шок, сывороточная болезнь и др.). Поэтому перед введением гетерогенных сывороток необходимо определить индивидуальную чувствительность организма к белкам животного - донора (обычно лошади) путем постановки внутрикожной пробы. Для этого лошадиную сыворотку, разведенную 1:100, вводят внутрикожно в ладонную поверхность предплечья в количестве 0,1 мл. Через 20 мин учитывают результат. При отрицательной пробе иммунную сыворотку вводят по методу Безредки – 0,1 мл подкожно и через 30 мин всю лечебную дозу внутримышечно или внутривенно.

При положительной внутрикожной пробе такую лечебную сыворотку вводят только по безусловным показаниям под наблюдением врача и с применением противошоковых мероприятий. Проводят десенсибилизацию дробным введением вначале лошадиной сыворотки, разведенной 1:100 в дозах 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мл с интервалом в 20 мин, а затем вводят цельную иммунную сыворотку в объемах 0,1; 0,2 мл, а затем всю оставшуюся лечебную дозу с промежутками в 20 мин.

Этого недостатка лишены гомологичные иммуноглобулины, которые получают из сывороток людей. Кроме того, такие антитела циркулируют в крови дольше (4-5 недель), чем гетерогенные. Иммуноглобулины получают из донорской, плацентарной или абортной крови человека. Выпускают противокоревой (нормальный) иммуноглобулин, который готовят из смеси сывороток крови разных людей. Он содержит антитела против возбудителей кори, гриппа, полиомиелита, коклюша, дифтерии и других бактериальных и вирусных инфекций. Группа иммуноглобулинов направленного действия содержит антитела против конкретного возбудителя. Их получают от гипериммунизированных вакциной или

109

анатоксином доноров. Например, в настоящее время медицинской промышленностью выпускают иммуноглобулин против гриппа, столбняка, клещевого энцефалита и др.

110