Основы общей микробиологии и иммунологии. Учебное пособие

антителами (реже с Ig M) и комплементом. Данные ИК фиксируются на рецепторах иммунокомпетентных клеток. Они способны проникать в ткани, откладываться вокруг сосудов, на синовиальных оболочках суставов, базальной мембране почечного эпителия и др. Это приводит к развитию аллергического воспаления, кровоизлияниям и некрозу. Поражения носят местный (феномен Артюса) или общий (сывороточная болезнь) характер.

4 тип – клеточноопосредованные реакции. Их особен-

ность состоит в том, что взаимодействие осуществляется между антигеном и предварительно сенсибилизированными иммунокомпетентными клетками (Т-хелперами, Т- супрессорами, макрофагами, клетками памяти). Эти клетки, активированные антигеном, вырабатывают различные цитокины, которые и вызывают воспаление. Данный тип реакций был впервые выявлен немецким бактериологом Р.Кохом в опытах на зараженных туберкулезом животных и получил название туберкулинового теста. Он используется с диагностической целью для выявления заболеваний туберкулезом. Аналогичные реакции развиваются и при других инфекциях.

Иммунный статус человека и его оценка

Иммунный статус характеризует функциональное состояние иммунной системы человека в конкретный период времени. Он определяется совокупностью показателей врожденных (конституциональных) факторов защиты (факторов естественной резистентности) и специфических реакций иммунной системы.

В случае выявления нарушений в системе иммунитета необходимо проведение иммунокоррекции, конечная цель которой – структурная и функциональная нормализация системы иммунитета.

Основные методы анализа иммунного статуса представлены в виде системы двухуровневого обследования па-

91

циентов. Они предусматривают применение клинических (жалобы больного, история заболевания, условия жизни и профессиональной деятельности, отягощенная наследственность, вредные привычки и др.), лабораторных и инструментальных методов обследования.

Тесты 1-го уровня – скрининговые, позволяют выявлять грубые нарушения в работе иммунной системы. Из лабораторных тестов используют:

•общеклинический анализ крови;

•определение фагоцитарной активности лейкоцитов;

•оценку В-системы иммунитета путем определения классов иммуноглобулинов, подсчетом абсолютного и относительного числа В-лимфоцитов в периферической крови;

•оценку Т-системы иммунитета на основе определения общего количества лимфоцитов, абсолютного числа и процентного содержания зрелых Т-лимфоцитов.

Тесты 2-го уровня включают более сложные методы клинической и лабораторной оценки функционального состояния иммунной системы. Определяют:

•количество Т-хелперов/индукторов и Т- киллеров/супрессоров на основе выявления мембранных маркеров (кластеров дифференциации – молекул CD) методом лазерной проточной цитофлюориметрии;

•присутствие молекул адгезии на поверхностной мембране нейтрофилов;

•субклассы иммуноглобулинов;

•присутствие белков острой фазы: маннансвязывающего лектина и С-реактивного протеина;

•наличие и активность белков системы комплемента;

•продукцию цитокинов;

•присутствие аутоантител;

•характер кожных тестов и др.

92

При нарушениях в любом звене иммунной системы возникают иммунодефицитные состояния. Различают первичные (врожденные) и вторичные (приобретенные) иммунодефициты.

•Первичные иммунодефициты (ПИД) являются на-

следственными заболеваниями и обусловлены наличием дефектов в генах (мутаций), которые контролируют работу иммунной системы. Главным клиническим проявлением ПИД является инфекционный синдром – повышенная восприимчивость к патогенным и условно-патогенным (оппортунистичеким) микроорганизмам, тяжелое клиническое течение инфекционных болезней, хронизация инфекций и др. ПИД классифицируют на основании того или иного дефекта

виммунной системе.

•Вторичные (приобретенные) иммунодефициты

(ВИД) возникают в результате воздействия на клетки иммунной системы факторов, вызывающих обратимые и необратимые иммунодефициты. К первым относят голодание, болезни обмена веществ (диабет и др.), ожоговую болезнь, психические депрессии. К агентам, вызывающим необратимый иммунодефицит, относят ВИЧ-инфекцию, суперантигены вирусов (кори, краснухи, герпеса, гепатитов и др.), бактерий (стафилококки, микобактерии) и грибов (кокцидиомицеты и др.), ионизирующую радиацию в запороговых дозах, некоторые злокачественные опухоли и др.

ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ИММУНОЛОГИИ

С теоретическими достижениями иммунологии тесно связаны крупнейшие достижения в области иммнодиагностики, иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней. Для этих целей используют биологические

93

препараты, общей характерной особенностью которых является специфичность действия и направленность против микроорганизмов определенного вида. Количество специфических биологических препаратов достаточно велико, методики их приготовления и требования, предъявляемые к ним различны.

Иммунодиагностика инфекционных болезней

При инфекционных заболеваниях во внутренней среде организма присутствуют возбудитель и его продукты (антигены, токсины, ферменты). Ответная реакция организма на присутствие таких агентов выражается в образовании антител или иммунных лимфоцитов. Возможность обнаружения специальными методами любого из участников иммунного ответа лежит в основе иммунодиагностики инфекционных болезней

Широко используют иммунохимические методы, которые называют также серологическими (от лат. serum – сыворотка), для обнаружения антител или антигенов микроорганизмов в биологических материалах от больных лиц. Эти методы в зависимости от характера и состояния антигена можно объединить в несколько групп:

•прямые методы взаимодействия и визуального определения результатов реакции антиген – антитело. Это реакции: агглютинации, преципитации, лизиса и связывания комплемента;

•методы пассивной агглютинации с использованием носителей антигена или антитела (реакции со свидетелями).

Кним относятся реакции: пассивной гемагглютинации, ла- текс-агглютинации, Ко-агглютинации и др.;

•реакции, основанные на использовании различных меток одного из участников взаимодействия антиген – антитело (ферментных, флюоресцирующих, радиоизотопных и др.). В зависимости от использованной метки эти тесты на-

94

зываются иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунологический тест (РИТ) и др.

Прямые реакции взаимодействия антигена с антителом осуществляются в две фазы – специфическую и неспецифическую. Первая специфическая фаза характеризуется комплементарным взаимодействием антигена с антителом с образованием иммунного комплекса, который визуально не определяется. Этот иммунный комплекс в присутствии изотонического раствора образует аггломераты, которые выпадают в осадок и хорошо различимы визуально – это вторая неспецифическая фаза реакции. В зависимости от состояния антигена видимая неспецифическая фаза образования иммунного аггломерата проявляется различно, что обусловливает разнообразие этих реакций.

Реакции агглютинации обусловлены склеиванием целых микробных клеток (агглютиногенов) гомологичными антителами (агглютининами) в присутствии электролитов, что проявляется образованием хорошо видимых хлопьев агглютината, который выпадает в растворе в виде осадка. Существуют различные модификации постановки реакций агглютинации в зависимости от целей исследований:

• Для идентификации чистой культуры микроорганизмов (агглютиногена), выделенной из материала больного, используют реакции агглютинации на стекле или в пробирках (развернутая реакция агглютинации типа Грубера). Антитела для этих реакций (классов Ig M или Ig G) содержатся в диагностических агглютинирующих сыворотках, полученных путем иммунизации кроликов определенными видами бактерий. Видовые агглютинирующие сыворотки используют для постановки ориентировочной реакции на стекле и развернутой реакции. Последняя ставится в агглютинационных пробирках с разведением сыворотки в физиологическом растворе до титра, который указан на этикетке препарата. Титр сыворотки – это наибольшее ее разведение (или наи-

95

меньшее количество антител) при котором реакция агглютинации будет положительной только с гомологичным антигеном. Например, если титр видовой сыворотки равен 1:12800, это значит, что чистая культура бактерий будет идентифицирована только в том случае, если реакция агглютинации будет положительна во всех разведениях сыворотки включая 1:12800. С адсорбированной или монорецепторной агглютинирующей сывороткой ограничиваются постановкой реакции на стекле. Это обусловлено тем, что такие сыворотки не содержат перекрестнореагирующих групповых антител.

• Для обнаружения антител в сыворотке крови больного используют развернутую реакцию агглютинации типа Видаля. В качестве антигена в этой реакции используют диагностикум, который готовят из взвеси убитых бактерий определенного вида. Количество антител выражают в титре, который изменяется в процессе заболевания. Обнаружение антител является косвенным свидетельством присутствия антигена в организме в данный период времени. Поэтому диагностически достоверным считается четырехкратное и более увеличение титров антител при вторичной постановке теста через 7-10 дней (исследование так называемых парных сывороток).

Реакции преципитации протекают с участием антигена – преципитиногена, который является молекулярным продуктом разрушенных клеток микроорганизмов и хорошо растворим в физиологическом растворе без образования помутнения. Таким антигеном может быть бактериальный белок, полисахарид, вытяжки из инфицированных органов и др. Степень разведения преципитиногена обычно велика 1:106 и более. Результатом взаимодействия такого антигена с антителами – преципитинами является выпадение мелкозернистого осадка или образования кольца (иммунного преципитата) на границе их контакта. Реакции преципитатации являются в основном качествеными методами исследования и

96

характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Существует несколько модификаций постановки реакции:

•реакция кольцепреципитации (термоиммунопре-

ципитации)– наслаивание антигена на преципитирующую сыворотку в специальных преципитационных пробирках. На границе соприкосновения антигена и антитела в положительных случаях образуется кольцо помутнения (преципитат). Примером является реакция Асколи, которая используется для выявления термостабильного сибиреязвенного антигена;

•реакции преципитации в геле. Выделяют несколь-

ко вариантов постановки таких тестов:

1.двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтер-

лони – заключается в следующем: на предметное стекло наносят тонким слоем агаровый гель, в котором делают лунки. Одну лунку заполняют антигеном, другую – антителом. Диффундируя в агар, они в месте встречи образуют одну или несколько линий преципитата в виде белых полос;

2.реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини

используется для количественного определения иммуноглобулинов разных классов, компонентов системы комплемента

всывороке и др. Принцип метода состоит в следующем: на твердую основу (стеклянную или полистироловую пластинку) наносят слой агара с моноспецифической антисывороткой к одному из классов иммуноглобулинов (антитело). В этом слое делают лунки, в которые вносят исследуемую сыворотку пациента (антиген). Антиген из лунок диффундирует

вгель, где встречается с антителами, что сопровождается образованием зоны помутнения в агаре (преципитат). Площадь этой зоны прямо пропорциональна количеству внесенного в лунки антигена (т.е. количеству иммуноглобулина определенного класса), который определяют по калибровочной кривой;

97

•методы иммуноэлектрофореза используются для выявления антигенов или антител в том случае, если миграция компонентов иммунного комплекса проходит в электрическом поле. Используют методы простого, ракетного или встречного иммуноэлектрофореза.

Реакция лизиса проявляется растворением (лизисом) микроорганизмов или других клеток в результате взаимодействия с антителом в присутствии комплемента. Антитела, вызывающие лизис клеток, называются лизинами: бактериолизинами (разрушают бактерии), спирохетолизинами (разрушают спирохеты), гемолизинами (лизируют эритроциты) и др. Реакции лизиса используются с целью определения вида возбудителей инфекционного заболевания или обнаружения антител в сыворотке крови пациентов. Реакцию ставят в пробирке или используют животных. В пробирочных тестах используют иммунные сыворотки, инактивированные прогреванием на водяной бане при 37˚С в течение 30 мин, что приводит к разрушению комплемента. В течение реакции лизиса выделяют несколько фаз, которые можно наблюдать под микроскопом:

•потеря подвижности микроорганизмами;

•набухание клеток;

•распад и растворение клеток.

Весь этот процесс занимает 15-20 мин. Результаты реакции можно учитывать, делая высевы из пробирок на плотные питательные среды. Отсутствие роста свидетельствует о положительной реакции лизиса.

Большое значение имеет реакция гемолиза – растворение эритроцитов при взаимодействии с антителамигемолизинами в присутствии комплемента. Гемолизины получают путем иммунизации кроликов эритроцитами животного другого вида (например, эритроцитами барана). Полученная сыворотка, содержащая гемолизины, называется гемолитической сывороткой. Реакция гемолиза проявляется

98

растворением (гемолизом) эритроцитов, при этом взвесь эритроцитов в физиологическом растворе превращается в прозрачную ярко-красную жидкость (лаковую кровь).

Реакция гемолиза, ввиду своей демонстративности, получила широкое распространение в лабораторной практике. Ее используют для определения титра комплемента и как индикаторную систему в реакции связывания комплемента

(РСК).

Реакция связывания комплемента (РСК) применя-

ется для обнаружения антител в сыворотке крови или для выявления антигена в материале от больного. Эта реакция основана на том, что при взаимодействии антигена с антителом образуется комплекс, который адсорбирует (связывает) комплемент. Однако этот феномен протекает в пробирке без видимых проявлений. Для выявления результатов реакции в качестве индикаторной системы используют реакцию гемолиза. Таким образом, в РСК используют две системы: специфическую, в которой определяют возможность образования иммунного комплекса антитело+антиген+комплемент, и индикаторную, гемолитическую систему, которая состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки к ним. Проведение реакции включает две фазы. В первую фазу проводят раздельную инкубацию специфического и индикаторного комплексов. Во вторую фазу смешивают указанные комплексы, что позволяет определить локализацию комплемента по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов. Так, если имеет место соответствие антигена и антитела происходит связывание этим комплексом комплемента, а реакция гемолиза будет отрицательной, т.к. в системе отсутствует свободный комплемент. Если же состветствия между антигеном и антителом нет, комплемент свяжется гемолитической системой, результатом чего будет гемолиз эритроцитов.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином

основана на способности антител (иммуноглобулинов) нейтрализовать биологическую активность экзотоксинов микро-

99

организмов, являются активными иммуногенами и индуцируют выработку в организме токсиннейтрализующих антител (антитоксинов). Реакция применяется для обнаружения антитоксинов в сыворотке крови больного, качественного и количественного определения выделяемого бактериями экзотоксина, присутствия токсина в биологических жидкостях. Для этого смесь иммунной сыворотки и токсина инкубируют в термостате в течение 30-60 мин, а затем вводят чувствительному животному. Если токсин нейтрализован антитоксином, то не происходит заболевания и гибели животного. Для контроля второму животному вводят смесь токсина и нормальной неиммунной сыворотки. Это животное погибает от действия токсина.

Методы пассивной агглютинации

Принцип этих методов состоит в использовании антигенов или антител, адсорбированых на поверхности различных неспецифических частиц (эритроцитов, латекса, клеток стафилококка, частиц бентонита, микрокапсул и др.), получивших название антигенных или антительных диагностикумов. При взаимодействии таких диагностикумов с антителами или антигенами в исследуемых материалах , образуются агрегаты, хорошо видимые за счет введенных в диагностикум таких неспецифических частиц.

В зависимости от используемых частиц-носителей в практике широко применяют реакции трех типов: реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА/РНГА), реакции латекс-агглютинации (РЛА) и реакции коагглютинации.

В реакции РПГА в качестве носителей антигена или антитела используют эритроциты животных, в результате чего получают соответственно антигенный или антительный эритроцитарный диагностикум. При постановке реакции с целью обнаружения антител эритроцитарный диагностикум,

100