Методы определения иммуномодулирующей (иммунотропной) активности фармацевтических препаратов

УДК 619:615.37(07)

ББК 48 АВТОРЫ:

Девришов Д.А., доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий кафедрой иммунологии и биотехнологии.

Марзанова С.Н., кандидат биологических наук, доцент кафедры иммунологии и биотехнологии.

Методы определения иммуномодулирующей (иммунотропной) активности фармацевтических препаратов.— М., ООО НПО «Издательство Сельскохозяйственные технологии», 56 с.

Учебно-методическое пособие предназначено для успешного усвоения теоретического и практического материала по оценке иммуномодулирующей (иммунотропной) активности новых лекарственных препаратов, фармакологических субстанций и вспомогательных веществ. В пособии приведены методы оценки влияния новых лекарств и потенциальных фармакологических субстанций на клеточные и гуморальные показатели иммунитета, а также про/антиаллергизирующего действия.

Учебно-методическое пособие предназначено для научных сотрудников, аспирантов, специалистов занимающихся контролем качества лекарственных средств, преподавателей профильных кафедр ветеринарных ВУЗов, магистров по направлению подготовки «Биология» и «Биотехнология».

Рецензенты:

Забережный А.Д., доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, заместитель директора по научной работе ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

Смоленский В.М., доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры зоогигиены и птицеводства им. А.К. Даниловой ФГБОУ ВО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина.

ISBN 978-5-6044741-8-1

DOI 10.18720/SPBPU/2/z20-24

Утверждено учебно-методической комиссией ветеринарно-биологического факультета (ВБФ) (протокол № 2 от «_15_»_сентября_ 2020 года)

© - Девришов Д.А., Марзанова С.Н.

2

О Г Л А В Л Е Н И Е

4

В В Е Д Е Н И Е

Настоящие методические рекомендации являются частью общей программы оценки безопасности фармакологических средств и способствуют унификации и оптимизации методических подходов по выявлению иммуномодулирующего (иммунотропного) действия новых и потенциальных лекарственных средств и риска для иммунной системы животных при применении с целью получения информативных и сопоставляемых результатов.

Возрастающие исследования по разработке новых лекарственных субстанций и количество публикаций о воздействии многих лекарственных форм на иммунную систему привело к необходимости оценки степени и механизма иммунотропного воздействия на организм. В отличие от установленных протоколов доклинического изучения общетоксического действия, методологические и методические проблемы исследования иммунотропности и иммунотоксичности постоянно совершенствуются и являются одними из основных информативных показателей оценки фармакологического действия [13, 20].

Предлагаемый комплексный подход к оценке иммунотропности действия фармакологических средств заключается в оценке ряда иммунологических функций, позволяющих определить иммунотропность и потенциал фармакологического средства с учетом функциональной активности иммунологических исследований.

При подборе тестов для испытания фармакологических средств на иммунотропное действие необходимо руководствоваться следующими принципами: информативностью, экономичностью, воспроизводимостью, оптимальным сочетанием методов иммунодиагностики in vivo и in vitro, использованием таких методов, которые бы позволяли выявить разные типы иммунных и аллергических реакций.

Воздействие на иммунную систему обязательно и проводится после оценки токсичности испытуемых фармакологических веществ [16,17]. Исследованию подлежат субстанции и все лекарственные формы. Если лекарственная форма содержит вспомогательные вещества (стабилизаторы, растворители и т.п.), не разрешенные для применения в ветеринарной

5

практике и не изученные ранее на этот вид активности, то каждое из этих веществ исследуют отдельно. При комбинации нескольких фармакологических веществ в одной лекарственной форме (фиксированная комбинация) изучают комбинации в целом и каждого ингредиента в отдельности на иммунотоксичность и аллергенность, если он не был ранее разрешен для применения в ветеринарной практике.

Подготовительная работа при проведении опытов in vivo заключается в выборе экспериментальных животных, способа введения и доз изучаемого препарата. Для изучения иммуномодулирующей активности препарата целесообразно использовать мышей линии СВА, BALB/c, СВ57/В1 и других, весом 18-20 г [2,6]. Необходимо, опытную и контрольную группу составляли животные одного возраста, пола, веса, получены одновременно из одного питомника и содержащиеся в одинаковых условиях. Введение исследуемого препарата в различных экспериментах должно осуществляться в одно и тоже время суток. Для получения стабильных и достоверных результатов на каждую дозу следует брать не менее 10 мышей. При проведении опытов in vitro в качестве источника материала рекомендуется использовать периферическую кровь здоровых мышей-доноров в возрасте от 20 до 50 дней.

Выбор низшей дозы препарата должен исходить из минимальной терапевтической дозы в перерасчете на грамм веса животного или на площадь тела. Высшая доза препарата должна составлять 1/10 от LD. При отсутствии информации о терапевтической дозе для опытов in vivo в качестве ориентировочных можно использовать дозы 1000 мкг, 100 мкг и 10 мкг на мышь для опытов in vitro 10 мкг, 1 мкг и 0,1 мкг на 1 мл питательной среды. Следует подчеркнуть, что эти дозы являются ориентировочными. При изучении нового вещества каждый экспериментатор должен выбирать и обосновывать дозы этого вещества для исследования самостоятельно. Способ введения препарата во всех экспериментах in vivo должен быть единообразным. Чаще всего в этих экспериментах используются подкожный, внутрибрюшинный или внутривенный пути введения препарата

[3,4,5].

Результаты экспериментов с опытной и контрольной группой должны

быть обработаны и сравнены статистически с использованием t-критерия

6

Стьюдента. Если вариационный ряд не несет черт нормального распределения, данные должны быть обработаны с помощью непараметрических методов. Результат влияния препарата на иммунитет, может быть рассмотрен как положительный, только при наличии статистически значимой разницы между контрольной и опытной группами.

1.Определение количества лейкоцитов и их субпопуляций

впериферической крови

Виммунологических реакциях организма принимает участие целый

ряд клеток и выделяемых ими растворимых биологически активных продуктов. Центральная роль в иммунном ответе принадлежит лейкоцитам. Они являются основными иммунокомпетентными клетками, которые отвечают воспалительной реакцией на внешние факторы, влияющие на организм и способны распознавать собственные и чужеродные антигены и отвечать активацией на контакты с ними.

Первым этапом исследования при оценке воздействия на иммунную систему всегда является подсчет общего количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы. Оцениваются как относительные, так и абсолютные значения количества клеток периферической крови [6,7].

1.1.Определение количественного содержания лейкоцитов

впериферической крови

Лейкоциты, являются форменными элементами крови. Они представляют собой ядерные бесцветные клетки, обладающие подвижностью

испособностью проникать через стенки кровеносных сосудов и эпителий.

Внорме у здорового взрослого животного в 1 мм3 крови в зависимости от вида содержится 5000–12000 лейкоцитов. Увеличение количества лейкоцитов в периферической крови выше нормы в 1 мм3 называется лейкоцитозом, а уменьшение – лейкопенией.

Лейкоцитоз характерен для ряда патологических (воспалительных) процессов, но может наблюдаться и у здоровых животных (в процессе пищеварения, при болевых ощущениях, физической нагрузке, стрессе).

К развитию лейкопении может привести воздействие физических факторов, контакт с некоторыми химическими агентами, инфекционных

заболеваниях, введение лекарственных препаратов.

7

Лейкопения развивается при аллергии (острые анафилактические реакции), токсикациях, ионизирующей радиации, белковом дефиците, витаминной недостаточности группы В, аутоиммунных процессах, вторичных иммунодефицитах, связанных с дефектом Т-клеточного звена иммунитета.

Для подсчета форменных элементов крови и клеточных суспензий используют камеру Горяева, представляющую собой специальное предметное стекло с выемкой, имеющей определенную глубину и разделенную по дну на 225 больших квадратов, часть из которых разделена на 16 малых квадратов. Глубина камеры составляет 0,1 мм. Площадь большого квадрата равна 1/25 мм2, а малого – 1/400 мм2. Рабочую площадку камеры окружают желобки, которые предназначены для сбора излишнего количества жидкости. Камера Горяева – точный измерительный прибор и требует бережного и аккуратного отношения.

Подсчет общего числа лейкоцитов в крови. Необходимые материалы и оборудование: световой микроскоп, камера Горяева, цельная кровь животных, взятая с гепарином, краска Задорожного-Дозморова или 3–5% раствор уксусной кислоты с метиленовым синим, автоматические пипетки.

Подсчет количества лейкоцитов в камере Горяева. Развести образец исследуемой крови в 20 раз 3–5% раствором уксусной кислоты с метиленовым синим (например, 20 мкл крови и 380 мкл раствора уксусной кислоты). Камеру и покровное стекло насухо протереть марлей.

Не допускается использование для протирки ватных тампонов из-за остающихся на стекле волокон. Аккуратно притереть покровное стекло к камере, слегка надавливая на него до появления цветных колец Ньютона.

Заполнить камеру разведенной кровью и выдержать 1 минуту для прекращения движения клеток. При малом увеличении (окуляр ×10, объектив ×8) посчитать лейкоциты в 100 больших квадратах. При подсчете числа клеток следует придерживаться следующего правила. В общее, число подсчитанных лейкоцитов включают все клетки, лежащие на верхней и левой сторонах квадрата камеры Горяева, но не учитывают клетки, расположенные на его нижней и правой сторонах.

8

Расчет числа лейкоцитов осуществляют, исходя из разведения крови (20) и числа больших квадратов (100), по формуле:

X = (a×250×20) / 100, где Х – число лейкоцитов в 1 мкл крови; а – число лейкоцитов, посчитанных в 100 больших квадратах камеры Горяева.

Количество посчитанных лейкоцитов умножают на 50. Полученная цифра – это количество лейкоцитов в 1 мм3 (1 мкл) исследуемой крови

[6,7,8].

1.2.Лейкограмма периферической крови животных

Лейкоциты – весьма неоднородная по составу совокупность клеток. Протоплазма лейкоцитов состоит из ядра, клеточной мембраны и цитоплазмы. Слово «протоплазма» происходит от греческого слова «протос» и означает «первый». В свою очередь «плазма» означает «сформированные вещи».

Протоплазма рассматривается как физическая основа жизни. Таким образом, цитоплазма является частью протоплазмы клетки. Клетки крови отличаются друг от друга по своему происхождению, морфологическими признаками, которые включают величину клеток, строение ядра, наличие гранул с физиологически активными веществами в цитоплазме, цитохимическими и функциональными свойствами.

Лейкоцитов делят на два основных типа, один из которых характеризуется зернистой цитоплазмой (гранулоциты), другой – незернистой (агранулоциты).

Существует три типа зернистых лейкоцитов или гранулоцитов, различающихся окраской цитоплазматических гранул: нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. К незернистым лейкоцитам или агранулоцитам относятся лимфоциты и моноциты [9,10,15].

Нейтрофилы – это лейкоциты, диаметром 10–15 мкм, гранулы которых при нейтральных значениях рН 7,0 не воспринимают ни основные, ни кислые красители. Они отличаются формами ядер, а не гранул, поэтому их часто называют полиморфно-ядерными лейкоцитами.

По этим качествам нейтрофилы разделяются на юные, палочкоядерные и сегментоядерные. Юные и палочкоядерные клетки являются незрелыми

9

формами нейтрофилов. Цитоплазма нейтрофилов бледно-розовая с обильной, неравномерной и мелкой зернистостью, окрашенной в розовато-синий или фиолетовый цвет. Ядро темно-фиолетовое палочковидное, либо сегментированное (2–5 сегментов). Большую часть клетки занимает бледнорозовая цитоплазма с обильной неравномерной мелкой зернистостью, окрашенной в розовато-синий или фиолетовый цвет (Рис. 1а, б).

Среди циркулирующих в крови лейкоцитов популяция нейтрофилов самая многочисленная, у человека она составляет 40‒70%, у большинства плотоядных — 60–75%, около 50% — у лошадей и 20‒40% — у жвачных (овцы, крупный рогатый скот) и у лабораторных грызунов.

Вкрови нейтрофилы формируют два примерно равных обменивающихся клетками пула — циркулирующий и маргинальный (пристеночный). Циркулирующие нейтрофилы находятся в крови 6‒14 ч, маргинальные нейтрофилы мигрируют в ткани (желудочно-кишечный тракт, легкие, печень), где живут до 7 дней (в среднем 2-3 дня), после чего подвергаются естественной гибели (апоптоз) и фагоцитируются макрофагами.

Внорме в крови обнаруживают палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы (Рис. 1 а, б). Как видно из рисунка 1 (a), ядро палочкоядерного нейтрофила имеют формы изогнутой палочки или ленты и в тонких местах содержит компактные непрерывные нити базихроматина. У сегментоядерного нейтрофила ядро разделено на отдельные сегменты различной величины и формы, которые связаны оболочкой ядра. Базихроматин ядра обычно скапливается в отдельные грубые комочки, преимущественно по его периферии, окрашивая ядро в темно-фиолетовый

10