Методы исследования сырья и продуктов растительного происхождения (теория и практика). Учебное пособие

температуре) к смеси добавляют 10 см3 раствора KJ и колбу прикрывают часовым стеклом. Через 5 мин в колбу прибавляют 200 – 250 см3 дистиллированной воды и выделившийся йод титруют 0,1 моль/дм3 раствором тиосульфата натрия, прибавляя в конце титрования 2 – 3 см3 раствора крахмала. Титрование заканчивают при появлении голубоватозеленой окраски раствора.

Пример. Определить количество спирта в водноспиртовом растворе, если известно, что на титрование свободного йода израсходован 1 см3 0,1 моль/дм3 раствора тиосульфата натрия. Исходный раствор разбавлен в 20 раз.

Количество спирта С определяют с учетом расхода 0,5 моль/дм3 раствора дихромата калия на его окисление, эквивалента 0,5 моль/дм3 раствора дихромата калия по спирту, а также разбавления исходного продукта (100 : 5 = 20):

С = (а – б : 5) · 0,0073 · 20= (10 – 1,0 : 5) · 0,146 = 1,43,

где а – объем 0,5 моль/дм3 раствора дихромата калия, взятого на окисление спирта, см3; б : 5 – объем 0,5 моль/дм3 раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование избытка дихромата калия, см3.

Контрольные вопросы

1.Каковы принципы объемного и массового определения концентрации этилового спирта в водно-спиртовых растворах?

2.Какова сущность физических и физико-химических методов определения концентрации этанола?

3.Каков принцип пикнометрического метода определения концентрации этилового спирта в водно-спиртовых растворах?

4.Каким образом применяют ареометрический метод определения концентрации этилового спирта в водноспиртовых растворах?

5.В чем состоит устройство и принцип действия стеклянного спиртомера?

111

6.В каких случаях применяют рефрактометрический метод определения концентрации этилового спирта в водноспиртовых растворах?

7.Каковы особенности интерферометрического метода определения концентрации этилового спирта в водноспиртовых растворах?

8.Каковы устройство и принцип действия интерферометра ИТР-2?

9.С помощью какого прибора осуществляется газохроматографический метод определения концентрации этилового спирта в водно-спиртовых растворах?

10.В чем состоит сущность химических методов определения концентрации этилового спирта в водно-спиртовых растворах?

6. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АМИННОГО АЗОТА

Азот входит в состав белков, нуклеопротеидов, фосфопротеидов и других соединений, играющих важную роль в жизни растений. Поэтому в растительном сырье в том или ином виде содержатся азотистые вещества. По способности выпадать в осадок под действием различных осадителей азотистые вещества делят на две основные группы: белковые и небелковые азотистые вещества, или белковый и небелковый азот. Белковым азотом богаты зерновые культуры, в которых белки занимают второе место после крахмала. Из общего содержания азотистых веществ в зерне (9 – 17 % в пересчете на сухое вещество) на долю белков приходится 85 – 95 %. В клубнях картофеля содержится 2 – 3 % азотистых веществ, из них до 50 % белков. В продуктах переработки растительного сырья азотистые вещества представлены, главным образом, продуктами распада белков (пептидами, аминокислотами), а также солями аммиака, азотистыми основаниями, амидами кислот и др. Так, в мелассе содержание небелкового азота составляет около 90 % от всех азотистых веществ.

В процессе производства часть белков зернового сырья под действием ферментов гидролизуется, вовлекается в тех-

112

нологический процесс и оказывает влияние на готовый продукт. Аминокислоты являются основными источниками азотистого питания микроорганизмов, участвуют в образовании ароматических и красящих веществ, высших спиртов и т. д. Пептоны и пептиды придают пиву пенистость и полноту вкуса. Но основная масса белков остается в отходах производств, поэтому перерабатывать высокобелковистое сырье экономически невыгодно. К тому же с повышением содержания белка уменьшается количество крахмала.

В связи с этим определению общего количества азотистых веществ, а также их различных форм в контроле бродильного производства придают большое значение.

Определение общего азота

Под общим азотом понимают сумму белкового и небелкового азота. Основным методом определения азота в органических соединениях является метод Кьельдаля. Метод основан на полном озолении навески исследуемого материала крепкой серной кислотой в присутствии катализаторов. При нагревании кислота разлагается на диоксид серы, воду и активный кислород, который окисляет углерод и водород органических соединений в СО2 и воду, а содержащийся в органических соединениях азот отщепляется в виде аммиака:

RCHNH2COOH+H2SO4=SO2+CO2+H2O+NH3.

Газы и вода улетучиваются, а аммиак связывается серной кислотой и остается в растворе:

2NH3+H2SO4= (NH4)2SO4.

Чтобы определить количество связанного аммиака, сульфат аммония разлагают щелочью:

(NH4)2SO4 + 2NaOH =2NH3 + Na2SO4 + 2 H2O.

Выделившийся аммиак отгоняют с водяным паром и улавливают 0,1 моль/дм3 раствором серной кислоты. Избыток кислоты оттитровывают 0,1 моль/дм3 раствором щелочи, и по разности между взятым объемом кислоты и объемом щелочи, пошедшей на титрование избытка кислоты, вычисляют количество 0,1 моль/дм3 раствора серной кислоты, связавшее аммиак.

113

1 см3 точно 0,1 моль/дм3 раствора серной кислоты связывает аммиак в количестве, соответствующем 1,4 мг, или

0,0014 г азота.

Для вычисления содержания белка количество азота умножают на коэффициент 6,25, условно принимая, что в белках в среднем содержится 16 % азота (100 : 16 = 6,25). Но надо иметь в виду, что в белках разного происхождения количество азота различно. Например, для ячменя и пшеницы коэффициент должен быть равен 5,70, овса и ржи – 5,83, риса –

5,95 и т. д.

Метод Кьельдаля отличается наибольшей точностью и принят в качестве эталонного метода при разработке новых методов определения азотсодержащих веществ. Однако одним из недостатков метода является длительность выполнения анализа, а также его трудоемкость, что затрудняет его применение, особенно при массовых анализах растительного сырья, полупродуктов и продуктов бродильного производства в производственных лабораториях. В связи с этим разработано много более быстрых методов, основанных на способности азота или самих белков давать окрашенные продукты реакции со многими соединениями. Однако по точности колориметрические методы уступают методу Кьельдаля.

Биуретовый метод определения белков (в модификации Дженнингса)

Метод основан на использовании известной цветной реакции на белки, содержащие группировку —СО—NH—, называемую пептидной связью. Он впервые использован для обнаружения производного мочевины – биурета.

Вещества, имеющие пептидные связи, в щелочном растворе CuSO4 образуют окрашенные медно-натриевые (-калиевые) комплексные соединения, причем белки дают фиолетовое окрашивание, а пептоны и полипептиды – краснофиолетовое. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству пептидных связей или концентрации белков. Измерив оптическую плотность окрашенного раствора, по калибровочной кривой находят содержание белков в навеске.

114

Метод отличается высокой чувствительностью и позволяет вести определение при разведении белков 1:10000. При анализе зерновых культур относительная ошибка не превышает 5 %.

Определение аминного азота

Аминный азот – азот, входящий в свободные аминогруппы –NH2 аминокислот и других продуктов гидролиза и других продуктов гидролиза белков. Его определяют при изучении активности протеолитических ферментов, состава форм азотистых соединений в сырье, полупродуктах и готовый продукции. Разработано много методов определения аминного азота, наиболее распространенные из них приводятся ниже.

Метод формольного титрования

В молекуле аминокислоты имеются свободная аминогруппа, обладающая основными свойствами, и свободная карбоксильная группа, обладающая кислыми свойствами. В водном растворе основные свойства аминогруппы почти нейтрализуются кислыми свойствами карбоксильной группы, в результате чего реакция раствора близка к нейтральной. Сёренсен предложил связывать аминогруппу формальдегидом:

Вследствие связывания аминная группа теряет свои основные свойства, а карбоксильная группа, наоборот, в полной мере проявляет свои кислотные свойства и может быть оттитрована щелочью.

Принимают, что количество карбоксильных групп равно количеству аминных групп, связанных формальдегидом. Однако такое предположение верно только для моноаминокарбоновых кислот.

115

Полная нейтрализация карбоксильных групп происходит лишь при рН 9 – 9,5, что соответствует ярко-красному окрашиванию фенолфталеина.

Для введения поправки на присутствие дикарбоновых аминокислот анализируемый раствор предварительно нейтрализуют щелочью до рН 7 по бромтимоловому синему.

Метод формольного титрования дает хорошие результаты только для прозрачных бесцветных или слабоокрашенных растворов. Мутные и темноокрашенные жидкости титруют электрометрически.

Йодометрический метод (по Попу и Стивенсу)

В основу метода положена способность аминокислот образовывать растворимые соединения с медью, количество которой определяют йодометрическим титрованием. Сущность метода заключается в том, что к слабощелочному раствору аминокислот прибавляют избыток суспензии ортофосфата меди Cu3(PO4)2 в обратном буферном растворе. Для отделения образовавшихся при этом растворимых медных соединений от нерастворимого ортофосфата меди смесь фильтруют. Затем к фильтрату прибавляют уксусную кислоту, которая отщепляет медь от комплексного соединения и превращается в ацетат меди.

Для определения количества меди, участвующей в реакциях, к раствору добавляют йодид калия: 2Cu(CH3COO)2 +

+4KI = I2+2CuI = 4CH3COOK. В результате реакции выделяется йод в количестве, эквивалентном количеству меди, а следовательно, и азоту аминокислот, который оттитровывают раствором тиосульфата натрия: I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI +

+Na2S4O6. 1 см3 0,01 моль/дм3 (0,01 н.) раствора тиосульфата натрия соответствует 0,28 мг аминного азота, так как один атом меди реагирует с двумя молекулами аминокислот, обра-

зуя соединения типа Cu(RCHNH2COO)2.

Пептиды также могут образовывать растворимые медные соли, но при этом один атом меди связывает лишь одну аминогруппу, следовательно, для них коэффициент перевода

116

равен не 0,28, а 0,14. Поэтому присутствие пептидов в анализируемом растворе вносит ошибку в определение.

Йодометрический метод определения суммарного количества аминокислот отличается экспрессностью и простотой. Он может быть рекомендован для оперативного контроля технологических процессов бродильного производства.

Лабораторная работа № 1. Определение содержания общего азота в зерне

методом Кьельдаля

Цель работы: освоить метод определения общего азота по Кьельдалю.

Оборудование и материалы: Колбы Кьельдаля вме-

стимостью 100 – 250 см3; установка для отгонки аммиака; конические колбы вместимостью 100 – 250 см3; стеклянные пробирки диаметром до 1 см; 0,1 моль/дм3 раствор серной кислоты; 0,1 моль/дм3 раствор гидроксида натрия; раствор гидроксида натрия с массовой долей 33 %; серная кислота х. ч., d = 1,84 г/см3; катализатор; смешанный индикатор; раствор борной кислоты с массовой долей 2 %, зерно.

Проведение анализа

Навеска для анализа должна содержать 20 – 40 мг азота. Сыпучий материал (зерно, солод) предварительно измельчают так, чтобы помол проходил через сито с ячейками размером

0,8 мм.

При анализе жидких продуктов пробу отбирают пипеткой в таком объеме, который содержал бы 20 – 40 мг азота. Пипетку с пробой опускают до дна колбы Кьельдаля и переводят в колбу пробу жидкости. Жидкость подкисляют несколькими каплями концентрированной серной кислоты и выпаривают сначала на малом огне газовой горелки, а затем в водяной бане до сиропообразного состояния. При выпаривании нельзя допускать подгорания и обугливания жидкости на стенках колбы.

117

При анализе муки навеску около 1 г отбирают в сухую пробирку и подвешивают ее при помощи проволочного кольца к крючку над чашкой аналитических весов. Пробирку с мукой взвешивают с точностью до ±0,0002 г. Затем муку пересыпают в колбу Кьельдаля, для чего колбе придают горизонтальное положение, вводят в ее горло по возможности глубже пробирку и, придерживая пробирку, ставят колбу вертикально, следя, чтобы частицы муки не попали на стенки горла. Пустую пробирку взвешивают и по разности двух взвешиваний находят величину навески. Анализ ведут в двух параллельных пробах и одновременно берут две навески для определения влажности.

Для сжигания отмеривают цилиндром 10 см3 концентрированной серной кислоты, небольшим ее объемом полностью смачивают массу навески (или выпаренную пробу), затем оставшейся кислотой смывают стенки колбы, добавляют 0,5 – 1,0 г катализатора, колбу закрывают специальной насадкой или стеклянной воронкой диаметром 3 – 4 см и наклонно устанавливают в вытяжном шкафу на сетке над горелкой. Выделяющиеся при сгорании газы сильно вспенивают массу и в начале сжигания нагрев регулируют так, чтобы масса не поднималась в горло колбы и не произошел ее выброс. Когда вспенивание прекратится и масса разжижится, нагрев усиливают и при слабом кипении заканчивают озоление до полного осветления раствора. При озолении нужно следить за тем, чтобы сильно не нагревалось горло колбы, на котором должны конденсироваться пары серной кислоты.

В процессе озоления колбу периодически встряхивают и переворачивают так, чтобы кислота и стекающий конденсат паров кислоты последовательно омывали всю внутреннюю поверхность колбы, не оставляя на ней обуглившихся частиц. После того как раствор приобретет синевато-зеленый без бурого оттенка цвет, кипячение продолжают еще 10 – 15 мин. Затем нагревание прекращают и колбе дают остыть.

При сжигании дверцы вытяжного шкафа должны быть закрыты, должно быть обеспечено полное удаление ядовитых газов. В охлажденную колбу по стенке небольшими порциями при перемешивании приливают 30 см3 дистиллированной во-

118

ды и приступают к отгонке аммиака на стандартной установке, показанной на рис. 7. В качестве парообразователя можно брать колбу на 2 дм3. В пробку этой колбы вставляют предохранитель в виде стеклянной трубки длиной около 1 м и диаметром 5 – 6 мм. Конец трубки не доходит до дна колбы на 3 – 5 см. Для регулирования кипения между парообразователем и воронкой для щелочи вставляют тройник (на рисунке не показан), на свободный конец которого надевают резиновую трубку с винтовым зажимом.

Конец трубки опускают в стакан, где собирается конденсат. Отгонка аммиака с помощью пара из той же колбы, в которой производилось сжигание анализируемой пробы, исключает возможность потерь аммиака.

В парообразователь 1 через воронку 2 наливают немного более половины объема дистиллированной воды, для предохранения от толчков при кипении бросают туда стеклянные капилляры, открывают кран 3 и зажим 4 и воду нагревают до кипения. Запасную пустую колбу Кьельдаля 10 надевают на резиновую пробку, в которую вставлены каплеуловитель 7 и воронка 5 для щелочи. Холодильник подключают к водопроводу, под холодильник подставляют пустую коническую колбу. После закипания воды в парообразователе закрывают кран 3, включают холодильник 8, подставляя под него колбу 9, и в течение 5 – 10 мин пропаривают установку, очищая ее и удаляя следы аммиака.

Затем открывают краны 3 и 6, а зажим 4 закрывают; отставляют коническую колбу из-под холодильника. В другую коническую колбу на 150 – 250 см3 из бюретки отмеривают 25 см3 0,1 моль/дм3 раствора серной кислоты (или 25 см3 раствора борной кислоты), добавляют 3 – 4 капли индикатора и подставляют ее под холодильник так, чтобы конец его трубки был погружен в раствор кислоты. Вместо запасной колбы Кьельдаля на пробку надевают колбу Кьельдаля, в которой производили сжигание.

119