Культивирование животных клеток. Учебно-методическое пособие

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«ЧЕЧЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АХМАТА АБДУЛХАМИДОВИЧА КАДЫРОВА»

Биолого-химический факультет Кафедра «Физиология и анатомия человека и животных»

С.С. Абумуслимов, З.А. Магомедова

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК Учебно-методическое пособие

Грозный – 2024

Печатается по решению Ученого совета ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет им. А.А. Кадырова»

(протокол № 11 от 28.11.2024)

и по решению УМС ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет имени А.А. Кадырова»

(протокол № 4 от 06.12.2024 г.)

УДК 611.018

ББК 54.11

Рецензенты:

Ирисханова З.И. – канд. биол. наук, заведующий кафедрой ботаники, зоологии и биоэкологии ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет имени А.А. Кадырова».

Кушалиева Ш.А. – канд. биол. наук, заведующий кафедрой экологии и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВО «Чеченский государственный педагогический университет».

Абумуслимов С.С., Магомедова З.А. Культивирование животных клеток. Учебно-методическое пособие / [Электронное издание] – Грозный: издательство ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет», 2024. – 50 с.

Учебно-методическое пособие рассматривает теоретические основы и практические методы культивирования некоторых типов клеток животных. В пособии приводится перечень оборудования, культуральной посуды и ростовых сред, необходимых для культивирования животных клеток. Важной частью пособия являются практические занятия, которые направлены на самостоятельное освоение методик получения первичной культуры и субкультивирования клеток животных.

Учебно-методическое пособие предназначено для биологов, биотехнологов, клеточных биологов, биофизиков, а также оно будет полезным для студентов старших курсов и магистрантов, решившим ознакомиться с методами культивирования клеток и тканей животных на практике.

©С.С. Абумуслимов, З.А. Магомедова, 2024

©ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет им. А.А. Кадырова», 2024

2

Список сокращений

МЭФ – мышиные эмбриональные фибробласты СПЭВ – клетки из эмбриональной почки свиньи Трипсин – фермент

Раствор Версена – натриевая соль на физиологическом фосфатном буфере Раствор Эрла – сбалансированный буферный солевой раствор Раствор Хенкса – сбалансированный буферный солевой раствор Среда Игла (МЕМ) – минимальная среда Игла, питательная среда Среда 199 – ростовая среда

DMEM – минимальная среда Игла (МЕМ) в модификации Дюльбекко In vitro – в пробирке

In situ – на месте

In vivo – в живом организме

HeLa – бессмертная (непрерывная) клеточная линия PBS – физиологический фосфатный буфер

3

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………….. 5

ГЛАВА 1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ …………………………………….. 7 1.1 Общие сведения о методе культивирования клеток и тканей ………… 7 1.2 Основные термины и понятия метода культивирования клеток и тканей ………………………………………………………………. 10

1.3Характеристика клеточной линии ……………………………………… 13

1.4Метод культивирования клеток ………………………………………… 16

1.5Работа с клеточными культурами ………………………………………. 18

1.6Условия для культивирования клеток ………………………………….. 20

ГЛАВА 2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ………………………………………. 28

Занятие 1. Бокс, ламинарный шкаф, оборудование, посуда,

среды и реагенты для культивирования клеток …………………………… 28

Занятие 2. Основные этапы культивирования животных ………………… 37

Занятие 3. Создание первичной культуры мышиных фибробластов …….. 38

Занятие 4. Создание первичной культуры эпидермоцитов кожи мыши или человека ………………………………………………………….. 43

Занятие 5. Исследование монослойных клеточных культур под световым микроскопом в учебных целях ………………………………….. 45

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………… 47

4

ВВЕДЕНИЕ

Метод культивирования клеток один из наиболее часто используемых методов клеточной биологии. Он является основой клеточной и тканевой инженерии. Суть метода состоит в том, что клетки тканей многоклеточных животных или растений можно выращивать вне организма животного или растения. Появление возможности выращивания клеток и тканей вне организма животного или растения позволила исследователям проводить наблюдения за жизнедеятельностью клеток в пробирке – «in vitro». При этом клетки лишаются их естественных связей, имевшихся целостном организме растения или животного.

С внедрением метода культивирования появилась возможность проведения исследований клеток и тканей в контролируемых условиях, ставить эксперименты на клетках и тканях, согласно потребностям и задачам исследователя. Наблюдения за клетками и тканями, растущих в культуральной среде, позволяют изучать различные проявления их жизнедеятельности: движение клеток, деление клеток, рост клеток, транспортные процессы и ряд других проявлений активности клеток. Воздействуя на клетки, путем введения в

культуральную среду ростовых факторов или токсинов, можно отслеживать реакции клеток. Например, введя в среду колхицин можно остановить митотическое деление клетки, блокировать расхождение хромосом к полюсам клетки. Колхицин нарушает полимеризацию микротрубочек веретена деления, что нарушает протекание митоза. Благодаря методу культивирования клеток и тканей стали возможны различные микрохирургические операции над клетками, например, гибридизация (слияние клеток), пересадка ядер из одной клетки в другую или получение клонов клеток, а также выращивание клеток и тканей в терапевтических целях.

Длительное культивирование клеток и тканей – дорогостоящая процедура. Культивирование клеток и тканей животных в монослое требует отдельного помещения для соблюдения асептики, лабораторное оборудование, дорогостоящих реагентов и питательных сред, богатых органическими и неорганическими компонентами, витаминами и ростовыми факторами.

Основная цель данного учебно-методического пособия состоит в том, чтобы студент или исследователь смог освоить элементарные теоретические основы и практические навыки культивирования клеток, в частности, клеток тканей млекопитающих. Поэтому в пособии приведены протоколы культивирования некоторых типов клеток животных организмов. Такие клетки можно получить самостоятельно из тканей животных и в дальнейшем культивировать с соблюдением соответствующих условий культивирования. Научиться получать собственные клеточные культуральные линии может быть более выгодным, так как стоимость готовых сертифицированных клеточных культур у фирм-производителей довольна высокая. В то же время, освоив основы культивирования клеток, студент или исследователь для научных исследований

5

может использовать уже существующие сертифицированные клеточные линии животных.

Учебно-методическое пособие состоит из двух частей: теоретической и практической. В теоретической части студент знакомится с основными сведениями по культивированию клеток и тканей. В практической части студент знакомится с лабораторным боксом, ламинаром, лабораторным оборудованием, посудой, реагентами и лабораторной посудой, необходимыми для культивирования клеток. В этой же части студент осваивает лабораторные методики получения собственных клеточных линий, субкультивирования клеточной культуры, условиями длительного хранения клеточной культуры и методами исследования с использования культуры клеток.

После освоения теоретической и практической частей учебнометодического пособия студент должен владеть навыками работы с культуральными клетками, уметь использовать клетки животных, выращенные in vitro, для учебных целей (приготовление временных и постоянных препаратов, прижизненные наблюдения за процессами жизнедеятельности клеток в нормальных условиях и при экспериментальных воздействиях).

Освоение методики культивирования клеток позволит студенту старших курсов не только повысить уровень биологической грамотности, выполнять текущие выпускные квалификационные работы, но и подготовиться в будущем для работы в области биотехнологии и клеточной инженерии.

В конце учебно-методического пособия приводится подробный список необходимой литературы для ознакомления с методом культивирование клеток и тканей. Для более углубленного изучения метода студент может обратиться к руководствам по культивированию клеток, приведенных в списке основной литературы.

6

ГЛАВА 1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1.1 Общие сведения о методе культивирования клеток и тканей

Некоторые микроорганизмы и клетки тканей в соответствующей среде, в которую их помешают, способны прикрепляться к твердой поверхности, подложке чашки Петри, флакона и размножаться в дальнейшем. Клетки тканей млекопитающих и других животных, если их культивировать в стеклянных емкостях и при условии сохранения неподвижности, могут оседать на дно емкости, прикрепляться и размножаться. При этом формируется тонкий ровный слой из растущих клеток. Такой слой культуральных клеток получил название «монослой» (19).

Впервые метод культивирования были применен еще в 1940 году У. Эрлом. Им была получена культивируемая клеточная линия мышей. В этот же период группа Т. Паку вырастила человеческие клетки in vitro (19). Более подробно историю развития метода культивирования можно посмотреть в источнике (2).

Для культивирования клеток необходимы специально оборудованное помещение и технические средства. Технические средства объединяют для удобства в группы по их месту в процессе работ с культурой клеток и тканей: 1) приборы и устройства для работы с культурой; 2) устройства и приборы для культивирования клеток и тканей; 3) микроскопы для периодического наблюдения за развивающимися клетками в культуральной среде; 4) устройства для криоконсервации (замораживания) и хранения клеточных культур.

Для культивирования клеток необходима питательная среда, которая должна содержать определенные компоненты.

Культура клеток и культивиривуемые клетки в молекулярной биологии используются в качестве модельной системы. На этих моделях изучается морфология, физиология и биохимия клеток. В частности, изучается обмен веществ и процессы старения клеток. Культура клеток используется для изучения воздействия лекарственных препаратов и токсических соединений на проявления процессов жизнедеятельности клеток, процессов опухолевой трансформации (канцерогенеза) и мутагенеза. Скрининг и разработка лекарственных препаратов, производство биологических соединений (вакцин, антител) является важным направлением использования культуры клеток. Главным преимуществом использования культуры клеток, как модельных систем, является то, что результаты различных практических исследований могут воспроизводиться. Это достигается использованием экспериментаторами и исследователями чистых клеточных линий-клонов.

Культивирование клеток на подожке в питательной среде предоставляет исследователю широкий спектр возможностей. Прежде всего, культивируемые клетки можно изучать прижизненно, то есть визуализировать живые клетки под световым микроскопом. Кроме того, культивируемые клетки в питательной среде воспроизводят в большой или меньшей степени морфологические и функциональные особенности тех тканей, из которых они были получены.

7

Примером могут служить кардиомиоциты сердца, которые в культуре формируют межклеточные контакты и могут даже синхронно сокращаться.

Клеточные культуры позволяют изучать дифференцировку клеток, механизмы деления и регуляции клеточного цикла и адаптацию клеток к воздействию различных факторов. Метод культивирования клеток широко используется в биотехнологии, в частности, для производства вакцин, при получении антител для научно-исследовательских целей. Этот метод востребован в медицинской сфере для диагностики заболеваний. Клеточные культуры выступают в качестве тест-объектов, на которых испытывают действие фармакологических препаратов прежде, чем препараты будут тестироваться на лабораторных животных. Например, культивируемые фибробласты, клетки соединительной ткани нашли успешное применение в биомедицине, оценке токсичности фармакологических препаратов. Культивируемые фибробласты можно перепрограммировать в другие клеточные линии, которые можно использовать в клеточной терапии (13).

Использование недифференцированных клеток животных позволяет проводить их культивирование на питательной среде, вне организма. Этот подход позволяет ставить эксперименты и проводить исследования на культивируемых клетках, которые невозможно проводить на целых организмах животного и человека (18).

Культуры клеток и тканей могут быть использованы для самых разных целей и задач. Если говорить в обобщенном виде, то они могут использоваться: для изучения внутриклеточных процессов (синтетические процессы в клетке, метаболизм), отслеживания потоков различных веществ внутри клеток (мембранный транспорт, движение гормон-рецепторных комплексов); характера взаимодействия с внешней средой (воздействие лекарственных средств на клетки и ткани, взаимодействие лигандов с рецепторов на клеточной поверхности), механизмов канцерогенеза, влияния токсинов на клетки (цитотоксичность), процессов инифицирования (заражения) и питания клеток; изучения взаимодействия клеток, клеточной подвижности и механизмов адгезии, кинетики пролиферации клеток, механизмов паракринного контроля между клетками, морфогенеза клеток и тканей; генетических процессов (анализ геномов клеток в нормальных и физиологических и патологических условиях, проведения генетических манипуляций с клетками, процессов трансформации клеток); получения клеточных продуктов (биотехнологические приемы получения таких продуктов, как белки, антитела, секреторных продуктов клеточной активности); для повышения производительности биотехнологических процессов с использованием биореакторов при производстве нужных человеку продуктов.

Среди недостатков метода культивирования можно отметить: необходимость строго соблюдения асептических (стерильных) условий для культивируемых клеток и тканей: высокая стоимость реагентов; необходимость поддержания культивируемых клеток в состоянии дифференцировки; нестабильность клеточных линий in vitro; вероятность заражения культивируемых клеток другими сопутствующими клеточными линиями.

8

К числу достоинств и преимуществ метода культуры клеток и тканей можно отнести: повторяемость и воспроизводимость результатов исследований на клеточных линиях in vitro; возможность контроля рН среды культивирования, осмотического давления и температурного режима для культуры клеток и тканей; возможность криохранения культуры клеток и тканей; высокая морфологическая и функциональная однородность клеточных линий и возможность сертификации любой клеточной линии. Также следует отметить, что метод культивирования клеток и тканей можно механизировать.

Хотя между клетками, растущими in vivo (растущими в организме животного) и клетками культуры, выращенными in vitro (растущими вне организма, в пробирке, чашке Петри) могут быть несовпадения в результатах наблюдений и научных исследований, тем не менее достаточно большое количество функций клеток можно изучать и воспроизводить in vitro. В этом отношении культура клеток и тканей является ценной моделью для научных исследований. Рассмотрим некоторые отличия клеток культуры in vitro от клеток, растущих in vivo. Пространственная трехмерная организация, геометрия ткани in vivo сохранена. Сохраняется in vivo также специфические межклеточные взаимодействия между клетками ткани. В культуре клеток и тканей, то есть in vitro, слой культуральных клеток имеет двухмерную пространственную геометрию, клетки не так сильно фиксированы, а обладают некоторой подвижностью. Скорость деления клеток in vitro выше, чем in vivo. Пространственные различия между тканями in vitro in vivo можно устранить с использованием скаффолдов-подложек. В результате чего у культуры клеток может формироваться трехмерная пространственная организация. Другое существенное отличие культуры клеток in vitro от клеток in vivo состоит в том, что могут различаться системные механизмы регуляции гомеостаза клеток и тканей. У клеток и тканей, развивающихся in vivo, имеется и функционирует нейрогуморальная регуляция. У клеток и тканей in vitro нервные и гормональные механизмы регуляции гомеостаза отсутствуют. Эта проблема у последних решается путем введения недостающих факторов регуляции (гормонов, ростовых факторов) непосредственно в ростовую питательную среду культивирования.

9

1.2 Основные термины и понятия метода культивирования клеток и тканей

Первичные клетки – зрелые клетки определенной ткани животного. Они являются дифференцированными клетками, которые либо вовсе утрачивают способность к пролиферации, либо потенциал к делению у них снижен. Первичные клетки – это те клетки, которые отделяются из ткани животного и в питательной среде формируют первичную клеточную культуру.

Стволовые клетки – клетки, способные к самоподдержанию, самообновлению и к дифференцировке. Эмбриональные стволовые клетки появляются во время раннего эмбриогенеза животного. Они формируют внутреннюю клеточную массу, или эмбриобласт, у зародыша. Постнатальные стволовые клетки представлены некоторой частью клеток взрослого организма. Их потенциал к дифференцировке в различные типы клеток ограничен по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками. Стволовыми клетками взрослого организма являются мультипотентные мезенхимальные (стромальные), гемопоэтические и тканеспецифические прогениторные клетки. Мезенхимальные стволовые клетки способны дифференцироваться в жировые, хрящевые и костные типы клеток.

По методу создания различают следующие типы культур: органная, эксплантная, клеточная. При создании органной культуры используют метод культивирования целостных кусочков ткани. При этом культивирование кусочков происходит на границе раздела сред – жидкой (питательной) и газовой среды. В кусочке ткани сохраняются сохраняются структурные и функциональные особенности ткани, а также межклеточные связи. Это способ создания культуры тканей не дает возможности получения постоянных клеточных культур. При формировании эксплантной культуры культивируемые клетки оказываются на границе жидкой фазы (питательной среды) и поверхности плотного субстрата (подложки). Это создает возможность активации механизмов миграции клеток кусочков ткани на поверхность подложки. При этом выселившиеся из кусочков ткани быстро пролиферируют. Это метод позволяет создать постоянные клеточные культуры.

Клеточные культуры. При создании клеточной культуры целостность кусочков ткани животного разрушается с помощью механической или ферментативной обработки. Клетки разрушенных кусочков ткани помещают либо на плотную подложку (адгезивные, прикрепляющиеся культуры), либо в жидкую фазу среды культивирования (суспензионные культуры). Полученная таким способом культура формирует постоянную клеточную культуру.

Предел Хейфлика – конечное число делений клеток. Например, человеческие клетки могут давать около 50 генераций, то есть их можно пересаживать до 50 раз. По некоторым данным 50 генераций могут дать культуральные клетки, полученные из эмбриональных тканей, а полученные из тканей взрослого организма могут дать приблизительно 20 генераций. После определенного количества делений они стареют и погибают. В то же время

10