Культивирование животных клеток. Учебно-методическое пособие

Инвертированный микроскоп используется для визуализации морфологии культивируемых клеток, оценки степени роста и прижизненных наблюдений. Оптические характеристики: объективы – х4, х10, х20 и х40. Освоить навыки работы с инвертированным микроскопом.

Рис. 6. Центрифуга (настольная)

Центрифугу используют для осаждения клеток и отделения их от старой ростовой среды при субкультивировании, пересевах в новую ростовую среду. Число оборотов: от 200 до 1000 об./мин. Освоить принципы работы с центрифугой.

Рис.7 Водяная баня

Водяная баня необходима для подогрева питательной среды, реактивов и растворов перед их использованием. Для размораживания замороженных клеток перед их использованием. Освоить с принципами работы с водяной баней.

31

Рис. 8. Холодильник, морозилка, резервуар с жидким азотом

Холодильные приборы используются для хранения реактивов, реагентов, сред и растворов, используемых в процессе культивирования. Некоторые из реагентов хранятся при температуре от 2 до 80С (холодильник). Большинство из них хранятся при температуре от -5 до -200С (морозилка). Для криоконсервации клеточных культур используется жидкий азот. Ознакомиться с правилами работы.

Рис.9. Шейкер Шейкер используется для перемешивания жидкостей, растворов, сред.

Рис.10. Камера Горяева (цитометр)

Камера Горяева используется для подсчета концентрации клеток культуры, например, при пересевах культуры. Ознакомиться с правилами работы с

32

камерой Горяева, например, проведя подсчет количества лейкоцитов в крови человека, используя практическое руководство по физиологии.

Рис.11. Автоматические пипетки, одноразовые пипетки Пастера, наконечники автоматических для пипеток

Пипетки используют для отбора жидкостей, пипетирования суспензии клеток культуры. Объем: от 2 мкл до 50 мл. Ознакомиться с правилами работы.

Рис.16. Стеклянная и пластиковая посуда и их характеристики: флакон – 300 мл, 75 см2; чашка Петри – диаметр 90 мм; луночная чашка: бывают - 6, 12 и 24луночной. Вверху показана 24-луночная чашка. В нижней части рисунка: культуральная посуда с ростовой средой.

Посуда используется для культивирования клеток. В посуде, заполненной ростовой средой, клетки культуры растут, формируют монослой. В новую чашку Петри перед пассажем можно поместить чистые стерильные покровные стекла для формирования на их поверхности монослоя из культивируемых клеток.

33

Пластиковая посуда – одноразовая, а стеклянную необходимо мыть и стерилизовать до и после использования.

Рис.17. Пробирки: центрифужные, Эппендорфа.

Пробирки используют для центрифугирования, отделения клеток культуры от старой ростовой среды. Если пробирки не одноразовые, то их необходимо мыть и стерилизовать. Ознакомиться с назначением разных видов пробирок.

Рис. 18. Сухожаровый шкаф

Шкаф необходим для стерилизации стеклянной посуды. Ознакомится с правилами работы.

Рис.19. Инструменты: ножницы, пинцет, скальпель, гистологическая игла

34

Инструменты используют для вырезания биологического материала, измельчения кусочков ткани и прочих манипуляций. Научиться безопасно работать с этими инструментами.

Рис.20. Спиртовка, спирт

Спирт используют для стерилизации инструментов (вносимых в ламинар), стерильного открывания и закрывания флаконов, чашек Петри с клеточной культурой, питательных сред во время работы непосредственно в ламинарном шкафу. Рекомендуется использовать 70% спирт.

Рис.21. Вверху: Среды и сыворотка; внизу: питательная среда (Игла) и растворы (Хенкса, буферный – жидкий и таблетированный)

Среды и растворы используют для культивирования клеток, промывок при пересевах. Руководствуясь данным пособием и используя следующие источники литературы (1, 2, 7, 8) ознакомьтесь более подробно с характеристиками и составом питательных сред, сывороток, буферных растворов, ферментами, антибиотиками, антимикотиками и другими реагентами, необходимыми для культивирования животных клеток. В частности, подробные сведения о перечисленных средствах для культивирования можно получить в Интернет у

35

фирмы-производителя: ООО «Биолот», http://www.biolot.ru/cfnflogue//.

Некоторые готовые среды, сыворотки, буферные системы и ряд других реагентов можно приобрести у этой фирмы.

Вопросы:

1.Для чего нужен бокс?

2.Как правильно разместить в боксе оборудование и другие принадлежности, необходимые для культивирования клеток?

3.Для чего нужен ламинар?

4.Как устроен ламинар, ламинарный шкаф? Что понимают под понятием

«стерильной» и «нестерильной» зоны ламинара?

4.Перечислите правила размещения предметов (сред, флаконов с культуральными клетками, пипеток, спиртовки и пр.) в ламинарном шкафу?

5.Зачем нужен СО2-инкубатор?

6.Перечислите основную культуральную посуду и опишите ее назначение?

7.Для чего используют центрифугу при культивировании клеток?

8.Как поддерживается стерильность (бокса, ламинара, сред, посуды) при культивировании клеток?

9.Где хранятся среды и реагенты для культивирования?

36

Занятие 2. Основные этапы культивирования клеток животных.

Цель занятия. Знакомство с основными этапами приготовления первичной культуры и ее субкультивирования. Рекомендуется также обратиться к руководствам по культивированию клеток (1, 2, 7, 8).

На этом занятии студент знакомится с основными стадиями получения первичной культуры клеток.

Основные этапы получения первичной культуры:

1.Забор биологического материала у животного (кусочек кожи размером 4х4 мм). Эту процедуру нужно выполнять стерильным инструментами. В качестве объекта можно использовать лабораторную мышь. От кусочка кожи можно отделить эпидермис и оставить дерму, или отделить избирательно эпидермис от дермы кожи. В первом случае первичную культуру сформируют фибробласты, а во втором – эпидермоциты.

2.Механическое измельчение фрагмента кожи в питательной среде с помощью ножниц, например, в чашке Петри. Добавление фермента (трипсина) и хелатирующих агентов для диссоциации клеток.

3.Помещение механически измельченного и обработанного ферментами материала (кашицу) в центрифужную пробирку.

4.Отделение клеток (фибробластов или эпидермоцитов) от остатков среды после механической и ферментативной обработки путем центрифугирования.

5.Высаживание клеток из надосадочной жидкости в питательную среду в чашку Петри. Культивирование в СО2-инкубаторе до заполнения клетками всего свободного пространства, то есть формирования монослоя. На этом этапе культура клеток называется «первичной культурой».

6.Субкультивирование (перевивание) клеток первичной культуры в новую чашку Петри с новой ростовой средой. После этого этапа культура клеток называется «клеточной линией».

7.Культивирвоание клеток до следующего пересева.

Сосновными этапами субкультивирования клеточной культуры можно ознакомиться в учебно-методическом пособии (7, стр. 29-36), а с методикой пересева клеточной линии HeLa - в руководстве (2, стр. 69-71).

Ниже будут представлены методики приготовления первичных клеточных культур животных, в частности, фибробластов и эпидермоцитов.

Вопросы:

1.Назовите и опишите основные этапы культивирования клеток?

2.Опишите все шаги по методике субкультивирования клеточной линии HeLa из Большого практикума (2), приведенной на страницах 69-71.

3.Какие среды и реактивы использованы в этой работе?

4.Где берут биологический материал для создания первичной культуры клеток?

5.Для чего проводят обработку кусочка ткани животного ферментами и хелатирующими агентами при создании первичной культуры?

6.Как соблюдается стерильность при работе с культурами клеток и тканей?

37

Занятие 3. Создание первичной культуры фибробластов.

Цель занятия: Создание новой собственной клеточной линии фибробластов (первичной культуры) и ее субкультивирование.

На этом занятии студент осваивает методику получения культуры фибробластов. Существуют разные способы получения первичной культуры из тканей животного. Для этого нужно выделить (отделить) клетки, например, фибробласты из кусочков ткани или органа животного. Первый способ отделения фибробластов от ткани предполагает механическое измельчение данного кусочка в питательной (ростовой) среде, а второй – добавление в механически измельченную кашицу ткани фермента. Часто оба эти подхода совмещают.

Если проведена только механическая обработка, то измельченную массу можно поместить в чашку Петри или во флакон. Из измельченных кусочков тканей животного начинают выселяться клетки на внутреннюю поверхность чашки Петри или флакона. Постепенно разрастаясь эти клетки формируют монослой.

Если сочетается механическая и ферментативная обработки ткани кусочков животного, то перед посадкой в чашку Петри или флакон кашицу нужно освободить от ферментов и хелатирующих агентов.

К числу удобных для получения клеточной линии и дальнейшего культивирования можно отнести фибробласты соединительной ткани млекопитающих.

Культивирование человеческих фибробластов. Стандартный набор компонентов питательной среды для культивирования человеческих фибробластов должен содержать девять незаменимых аминокислот (обязательными аминокислотами при этом являются глутамин или цистеин), витамины, сыворотку, сахар, множество гормонов и факторов роста. Температура культивирования клеток должна быть равной 370С.

Для культивирования фибробластов человека, обычно, в стерильных условиях вырезают небольшой кусочек (лоскуток) кожи (2-4 мм). Этот кусочек измельчают как можно мельче в чашке Петри в питательной среде. Из осевших на дно чашки Петри кусочков ткани начинают выселяться фибробласты, они делятся постепенно заполняя свободное пространство. В среднем через 8-14 дней формируется монослой. После того как фибробласты полностью заполняют свободное дно чашки Петри они престают делиться из-за явления контактного торможения. В отличие от них у опухолевых клеток не наблюдается контактное торможение и они могут делиться в культуре бесконечно долго при создании соответствующих условия для их культивирования.

Культивируемые фибробласты чувствительны к изменению температуры среды культивирования. При подъеме температуры выше 370С они погибают. Культивируемые фибробласты можно сохранить на длительный период времени, если их заморозить. Их замораживают в соответствующей среде для криоконсервации, помещая в резервуар с жидким азотом при температуре -1960С.

38

В книге Э. Пассарга на странице 119 (18) приведена схема культивирования человеческих фибробластов. Там же приводится схема получения гибридных клеток (гибридом).

Ход работы:

Получение первичной культуры мышиных фибробластов (МФ) (3).

1.Вырезают небольшой кусочек кожи (4х4 мм) у лабораторной мыши, освобождают дерму от верхнего слоя эпидермиса и нижележащих тканей. Перед вырезанием участок кожи мыши нужно предварительно обработать спиртом (70%), а при оперировании пользоваться стерильными инструментами. Далее все последующие операции проводят в асептических условиях (в ламинаре). Дерму помещают в пенициллиновый флакон, добавляют раствор трипсина и проводят ее измельчение до гомогенности с помощью ножниц.

2.К полученному гомогенату добавляют приготовленную на ростовой среде коллагеназу. Активность коллагеназы должна быть от 0,28 до 630 ЕД/мл. Инкубируют гомогенат в этой среде в течение 10-15 минут.

3. Добавляют к инкубированной смеси ростовую среду с 10% сыворотокой для нейтрализации фермента-коллагеназы.

4.Переносят смесь в центрифужную пробирку, центрифугируют при скорости 1000 об./мин в течение 5 минут при комнатной температуры.

5.Сливают надосадочную жидкость (супернанатант) из пробирки. К осадку из клеток добавляют полную ростовую среду, приготовленную на основе среды Игла. Переводят осадок в суспензию тщательно перемещав ее пипеткой с наконечником. При этом можно втягивать и выпускать суспензию в пипетку, чтобы добиться хорошей гомогенности.

6.Подсчитывают концентрацию клеток в суспензии в камере Горяева. 7.Перносят суспензию клеток в чашку Петри (например, пластиковая чашка Петри объемом 5 мл) из расчета 20000 клеток на 1 см2 площади. 8.Культивируют клетки с новой средой до формирования монослоя клеток, поместив чашку Петри в СО2-инкубатор, при температуре 370С.

9.На следующий день после инкубации сливают старую среду, заменяя ее на свежую порцию новой полной ростовой среды.

10. Культивируют клетки в инкубаторе до формирования монослоя. Таким образом, в результате мы получаем первичную культуры мышиных фибробластов. Сам процесс формирования монослоя, роста фибробластов может занять время от нескольких дней до недели (4-8 дней).

11.Во время культивирования необходимо контролировать культуру клеток на предмет заражения. Обычно, исследователь определят, есть ли заражение, по изменению рН ростовой среды. В готовых средах уже имеется индикатор, поэтому изменение рН изменяет цвет ростовой среды с культуральными клетками. Также можно и визуально оценить изменение цвета культуральной среды, исследовав чашку Петри на просвет: закисленная питательная среда становится мутноватой. При необходимости нужно сменить среду.

12.Через 4-8 дней, то есть когда клетки культуры заполнили все свободное пространство вокруг себя примерно на 80-90%, можно провести первое

39

субкультивирование (пересев, пассаж) в новые чашки Петри или флаконы с новой свежей полной ростовой средой. Но для этого сначала необходимо снять прикрепленные клетки.

Субкультивирование (1-й пересев первичной культуры клеток) мышиных фибробластов. Все операции необходимо проводить с соблюдением стерильности.

1.Слить прежнюю среду с культивируемых клеток во флаконе или в чашке Петри.

2.Два раз промыть клетки в чашке Петри в PBS.

3.Добавить раствор трипсина на PBS в концентрации в 0,5 мл раствора.

4.Инкубировать в растворе трипсина в течение 5 минут при 370С.

5.Не удаляя раствор трипсина добавить в чашку Петри с культуральными клетками у мл ростовой среды.

6.Перенести суспензию клеток из чашки Петри в центрифужную пробирку. Туда же переносят взвесь, получаемую при промывке чашки Петри (или флакона) PBS.

7.Центрифугировать взвесь при 1000 об./мин на протяжении 5 минут.

8.Слить надосадочную жидкость, добавить к осадку в пробирке 3 мл новой свежей полной ростовой среды и пипеткой хорошо перемещать.

9.Подсчитать концентрацию клеток взвеси в пробирке, используя камеру Горяева.

10.Рассадить клетки в новую чашку Петри (или флакон) из расчета 2х104 клеток на 1 см2 площади чашки Петри (флакона).

11.Добавить в эту чашку Петри (флакон) с клетками новую порцию полной ростовой среды, доведя общий объем питательной среды с клетками до 5 мл.

12.Культивировать в СО2-инкубаторе до следующего пересева.

Таким образом, после пересева (субкультивирования) первичная культура будет представлять собой клеточную линию.

Важно заметить, что культивируемые клетки, начиная с этапа субкультивирования можно посадить также на покровные стекла, чтобы получить монослой клеток на их поверхности. В дальнейшем с покровными клетками с монослоем из культивированных клеток можно работать, например, получить обзорные препараты, проводить иммуноцитохимические и электронномикроскопические исследования. Для того, чтобы вырастить монослой на покровных стеклах необходимо их тщательно вымыть, высушить и покрыть коллагеном или полилизином. Такие стекла помещают в чашку Петри (или флакон) и туда же переносят суспензию культивируемых клеток с учетом разведения и добавлением ростовой среды. Через какое-то время (4-8 дней) культуральные клетки (фибробласты) полностью сформируют монослой на поверхности покровных стекол.

Таким образом, итогом этого практического занятия является получение первичной культуры фибробластов мыши.

40