Культивирование животных клеток. Учебно-методическое пособие
.pdfСубкультирование нужно проводить спустя несколько суток, когда первичная культура заполнить поверхность дна чашки Петри или флакона приблизительно на 80-90%.
Получаемые из кусочков кожи мыши или человека фибробласты обладают меньшей пролиферативной активностью по сравнению с фибробластами, получаемыми из эмбриональных тканей. Ниже мы приводим ссылку на работу и фрагмент методики получения культуры мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ). Предпочтительнее получать именно такую культуру фибробластов. Рассмотрим один из методических подходов.
Методика получения первичной культуры мышиных эмбриональных фибробласто (10):
1. Забивают беременную самку мыши 13 или 14 дней. Извлекают рога матки с эмбрионами мыши, споласкивают 70% спиртом и помещают в PBS без ионов кальция и магния. Дальнейшие процедуры проводятся в стерильных условиях и в стерильной посуде. Помещают рога матки в новую чашку Петри и высвобождают каждый эмбрион, отделяя от плаценты. У извлеченных эмбрионов удаляют головную часть и все внутренние органы. Далее измельчают ножницами останки эмбрионов до консистенции кашицы, чтобы ее можно было бы пипетировать (10).
2.В эту кашицу необходимо внести 1 мл 0,05% трипсин/ЭДТА (Gibco, Invitrogen), содержащей 100 ед. ДНКазы 1 Кунитца (USB), в расчете на 1 измельченный эмбрион.
3.Для инактивации трипсина необходимо добавить к смеси в пробирке 500 мл свежеприготовленной ростовой среды для мышиных эмбриональных фибробластов. Состав добавляемой среды: 450 мл среды DMEM, 50 мл FBS, 5 мл L-глутамин (1/100), 5 мл смеси пенициллин-стрептомицин (1/100).
4.Смесь после инкубации с трипсином переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при скорости 300 об/мин в течение 5 минут. Затем сливают надосадочную жидкость и к осадку добавляют теплую среду для мышиных эмбриональных фибробластов. Тщательно пипетируют смесь микропипеткой, добиваясь гомогенности суспензии.
5.Переносят суспензию клеток в стерильные флаконы, покрытые 0,2% желатином (Gelatine из кожи быка, тип В, Sigma). При этом в каждый флакон переносят количество клеток эквивалентное 3-4 использованным эмбрионам мыши. То есть не проводя подсчета клеток в суспензии с помощью цитометра (камеры Горяева).
6.При удачном выполнении всех процедур приготовления мышиных эмбриональных фибробластов уже после 24 часа спустя могут пролиферировать и заполнить свободное 80-90% пространство. Часть клеток можно пересевать, а часть можно заморозить для дальнейшего использования. Также можно найти методику получения мышиных эмбриональных фибробластов в более раннем руководстве (1).
41
Вопросы:
1.Как получают первичную культуру фибробластов?
2.Откуда можно брать ткань животного для получения культуры фибробластов?
3.На каком этапе используют центрифугирование и для чего?
4.Как определят момент, когда нужно пересаживать культуру?
5.Какие среды и реагенты используют для работы с культурой фибробластов?
42
Занятие 4. Создание первичной культуры эпидермоцитов кожи мыши или человека (3).
Цель работы: Поучить первичную культуру эпидермоцитов из кожи животного.
1.Получают кусочек кожи мыши (или человека) (срез) размером 4х4 мм с соблюдением асептических условий.
2.Срез помещают в стеклянную или пластиковую пробирку с средой Игла, содержащей антибиотики - пенициллин в концентрации (25000 Ед/мл), стрептомицин (25000 ЕД/мл) – и антимикотик фунгизон. В этой среде культивируют на протяжении 24 часов при комнатной температуре.
3.После этого срез хорошенько отмывают несколько раз в чистой среде Игла. Отмывают до тех пор, пока среда в пробирке не станет прозрачной.
4.Добавляют раствор ЭДТА и инкубируют приблизительно 20 минут при комнатной температуре.
5.Переносят срез в раствор трипсина (0,005%) в пробирке. При этом пробирку можно поместить в холодильник при температуре +40С на 18 часов.
6.Удаляют раствор трипсина и добавляют в пробирку сывортку, которая нейтрализует действие фермента.
7.Пеносят срез в чашку Петри с сывороткой, выделяют эпидермоциты либо встряхивая или пипетируя содержимое чашки Петри. Как правило, эпидермоциты из среза после обработок ЭДТА и трипсином легко вываливаются в чашку Петри.
8.Сыворотку с эпидермоцитами переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 1000 об./мин на протяжении 5 минут.
9.После центрифугирования сливают надосадочную жидкость, плотный осадок из эпидермоцитов в пробирке ресуспендируют в новой порции среды Игла без ионов Са2+, путем пипетирования (втягивания и вымывания) среды Игла в пипетку. Получаем суспензию эпидермоцитов в пробирке.
10.Определяют концентрацию эпидермоцитов в суспензии.
11.После расчета концентрации вносят суспензию с эпидермоцитами в стеклянные или пластиковые чашки Петри (флакон), предварительно покрытые коллагеном, с полной ростовой средой из расчета от 70000 до 100000 клеток на 1 см2 площади культуральной чашки или флакона. Обычно, объем ростовой среды в чашке Петри или флаконе должен быть 5 мл.
12.Помещают чашку Петри или флакон в СО2-инкубатор при 370С.
13.Два раза производят смену культуральной ростовой среды.
14.Формирования монослоя клеток, то есть степень разрастания и заполнения свободного пространства вокруг эпидермоцитов, можно периодически контролировать под инвертированным микроскопом с помощью фазового контраста.
15.Субкультивирование эпидермоцитов можно провести аналогично субкультивированию культивируемых фибробластов (см. выше).
43
Можно научиться получать культуры других клеток животных. Получение культуры лимфоцитов из периферической крови человека или мыши и клеток других тканей описано в источнике (2) на страницах 50 и 86, а также в руководстве (17) на страницах 550-551 и 553-555. Получение первичной культуры клеток-зёрен (нейронов) мозжечка крысы описано в (2) на страницах
90-96.
Метод культивирования клеток эмбриональных стадий развития млекопитающих, ранних эмбрионов подробно описан в руководстве (12). Длительное культивирование эмбрионов млекопитающих (in vitro) требует очень строгого соблюдения ряда условий культивирования так, как ранние зародыши очень чувствительны к компонентам питательной среды, температурному режиму и к составу газовой среды (12). Для решения биологических задач можно получать эмбрионы, которым дают развиваться до определенных стадий в материнском организме (in situ) и тогда не требуется длительное культивирование (11). Извлекать эмбрионы из беременной самки мыши можно, начиная со стадии зиготы вплоть до стадии бластоцисты (имплантации). Извлекают эмбрионы в заранее приготовленную питательную среду для эмбрионов млекопитающих. Извлеченные эмбрионы можно прикреплять к покровным стеклам в специально изготовленных камерах. В таких камерах эмбрионы можно изучать с помощью иммуноцитохимических и электронномикроскопических методов.
Криоконсервация клеток культуры. Культивируемы клетки можно замораживать и хранить достаточно продолжительное время до повторного использования. Для этого культуральные клетки обрабатывают криопротекторами (глицерином, ДМСО (диметилсульфоксид)). Культуральные клетки, обработанные криопротектором, помещают в специальные пробирки и размещают в холодильных камерах или в резервуарах с жидким азотом при температуре -1300С и могут хранится длительное время. При необходимости клетки размораживают и высевают в новую посуду с ростовой средой. Подробно метод криоконсервации описан в руководстве (2) на страницах 65-67. В замороженном виде культуральные клетки можно транспортировать, поместив их в сосуд со льдом, специальный контейнер.
Вопросы:
1.Опишите все этапы получения культуры кератиноцитов?
2.Какие условия (газовый состав, температура, среда) требуются для культивирования кератиноцитов?
3.Опишите морфологические различия кератиноцитов и фибробластов культуре?
4.Как получают культуру лимфоцитов периферической крови человека или мыши?
5.Для чего используют криоконсервацию культуральных клеток?
44
Занятие 5. Исследование монослойных клеточных культур под световым микроскопом в учебных целях
Цель занятия: Овладеть методом микроскопирования клеток монослоя, выращенных на покровных стеклах, их фиксации и окрашивания, прижизненного наблюдения в фазовом контрасте.
Монослойные культуры можно использовать для выполнения самых разнообразных задач. Клетки монослойной культуры, особенно выращенные на покровных стеклах, очень удобны для приготовления временных или постоянных цитологических препаратов. При приготовлении постоянного цитологического препарата выполняются все те же процедуры, как и при приготовлении гистологического препарата: фиксация, окрашивание и заключение в канадский бальзам. При этом нет необходимости резать ткань, так как клетки культуры хорошо распластаны, имеют небольшую толщину и формируют монослой по всей поверхности покровного стекла. Покровные стекла с клетками можно переносить из одного раствора (среды) в другой с помощью пинцета.
Вкратце методика получения постоянного препарата из клеток монослоя выглядит следующим образом:
1.Покровное стекло с монослоем, например, из эмбриональных фибробластов переносят в фиксатор (10% формалин, 70%спирт), фиксируют от нескольких десятков минут до одного часа. О том, как вырастить монослой на покровных стеклах говорилось выше.
2.Фиксированные клетки монослоя прополаскивают в фосфатном буфере.
3.Отмытые в буфере фиксированные фибробласты на покровном стекле, можно сразу же окрасить гистологическими красителями, приготовленными на водной основе. Если краситель на спиртовой основе, то лучше предварительно фиксировать покровные стекла с фибробластами в 70% спирту и из спирта сразу перенести в краситель.
4.Отмыть покровное стекло от красителя (буфером или спиртом).
5.Произвести обезвоживание препарата, если краситель был на водной основе. Для этого последовательно промывают препарат в спиртах 70% и 96%. Проводят через смесь ксилола и спирта и после окончательной промывки в ксилоле заключают в канадский бальзам. С техникой посадки культуральныъх клеток на покровные стекла также можно ознакомиться в руководстве (2, стр. 71-74). При работе с покровными стеклами с монослоем важно, чтобы поверхность покровного стекла с монослоем была обращена вверх. Как правило, сторона покровного стекла с клетками выглядит матовой. Методика окрашивание гематоксилином культуральных клеток HeLa, выращенных на покровных стеклах, дана на страницах 125-126 указанного источника.
Культуральные фибробласты или других клетки позвоночных на покровных стеклах можно использовать для имунноцитохимических исследований или гибридизации in situ.
45
При иммунноцитохимическом исследовании фибробласты на покровных стеклах нужно предварительно поместить в лизирующую смесь и далее использовать для окрашивания различными антителами к клеточным структурам. Например, при окрашивании антителами к тубулину можно изучить морфологию тубулинового цитоскелета и центросомы в интерфазной клетке или митотическое веретено в митотической клетке. Окрашенные антителами препараты исследуют под флуоресцентным микроскопом. При этом места связывания антител будут давать свечение, указывая на локализацию исследуемой клеточной структуры.
Другим преимуществом использования монослойных культур является возможность прижизненного (витального) наблюдения за жизнедеятельностью клеток под световым микроскопом. Наблюдения за культуральными клетками при этом ведутся в их естественной среде, то есть в питательной среде. Использование инвертированного микроскопа с фазово-контрастным устройством позволяет разместить чашку Петри или флакон с культурой клеток прямо на предметном столике инвертированного микроскопа. У инвертированного микроскопа свет (освещение) падает на изучаемый объект сверху, а объективы расположены под предметным столиком. В принципе живые клетки можно увидеть при использовании метода «светлого поля», но при этом выявляется мало деталей. С системой фазового-контраста в инвертированном микроскопе можно увидеть больше деталей в клетках культуры. Например, можно увидеть в клетках центросому, веретено деления, структуру хроматина и ядрышко в ядре. Хорошо отслеживаются фазы митоза в динамике.
Помимо использования фазового-контраста усилить контрастность живых культуральных клеток можно проведя прижизненное (витальное) их окрашивание. Часто для этих целей используют метиленовый синий и трипановый синий. При окрашивании метиленовым синим хорошо контрастируются базофильные структуры клетки (ядро, ядрышки, хроматин, хромосомы).
Прижизненное окрашивание трипановым синим клеток культуры используют с целью оценки выживаемости и жизнеспособности. Например, проникновение в клетку красителя и диффузное окрашивание ею цитоплазмы указывают на нарушение целостности и проницаемости плазматической мембраны. Метод окрашивания трипановым синим культивируемых клеток является общепринятым («экспресс-методом») методом оценки жизнеспособности культуры клеток (2).
Дополнительную информацию о прижизненных наблюдениях клеток культуры можно получить из руководства (2) на страницах 97-111.
46
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Основная литература
1.Адамс Р. Методы культивирования клеток для биохимиков/Р. Адамс. – М.: Мир. – 1983. - 262 с. (основы культивирования клеток).
2.Большой практикум по клеточной биологии. Учебное пособие для студентов старших курсов биологических специальностей/Под редакцией: доктора биологических наук Р.Э. Узбекова. – М.: Издательство «Перо». – 2021. – 468 с. (теоретические и практические основы культивирования клеток животных, культивирование HeLa).
3.Микроскопическая техника: Руководство/Под ред. Д. С. Саркисова и Ю. Л. Перова. – М.: Медицина. – 1996. – 544 с. (изложена методика культивирования некоторых типов клеток животных – эпидермоцитов, фибробластов).
4.Новые методы культуры животных тканей. Пер. с англ. к.б.н., И.И. Фридлянской. Под ред. Проф. Ю.М. Оленова. – М.: Издательство «Мир». – 1976. – 255 с. (основы культивирования, состав ростовых сред, реагентов для культивирования, использование культуры тканей).
5.Прилепинский А.Ю. Методы работы с клеточными культурами и определение токсичности наноматериалов/А.Ю. Прилепинский, А.С. Дроздов, В. А. Богатырев и [др.]. – СПб.: Университет ИТМО. – 2019. – 43 с. (основы культивирования, рисунки оборудования, бокса, ламинара и пр.).
6.Современные способы выделения и культивирования клеток человека и животных: учебное пособие/Т.Д. Колокольцова, И.Н. Сабурина, А.А. Кубатиев. – М.: ФГБОУ ДПО РМАНПО. – 2016. – 50 с. (иллюстрированное руководство по культивированию клеток и тканей, содержит рисунки оборудования, сред и пр.).
7.Трухан И.С. Питательная среда как ключевой фактор культивирования клеток млекопитающих/И.С. Трухан//Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - №12. – 2018. – С. 165-172. (обзор по питательным средам для клеток млекопитающих и рекомендации по их использованию).
8.Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство/Н. Я. Фрешни. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2010. – 691 с. (полное руководство по культивированию клеток: получение первичных культур, субкультивирование, клеточные линии).
9.Черкасова Е.И. Работа с культурами клеток/Учебно-методическое пособие/Е. И. Черкасова, А.А. Брилкина. – Нижний Новгород: Издательство Нижегородского университета. – 2015. – 57 с. (подробно о культивировании животных клеток).
10.Jozefczuk J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells/J. Jozefczuk, R. Drews, J. Adjaye//Journal of Visualized Experiments. – 2012. - № 64. – e3854. –
47
P. 1-5. DOI: doi:10.3791/3854. (методика получения культуры мышиных эмбриональных фибробластов).
Дополнительная литература
11.Абумуслимов С.С. Взаимоотношение центров организации микротрубочек
ицентриолей: Исследование гигантских клеток слюнных желез Chironomus
ираннего эмбриогенеза мышей Mus muskulus. Дис. канд. биол. наук. – М.: Изд-во МГУ. – 1994. – 164 с. (методика работы с ранними эмбрионами мыши).
12.Биология развития млекопитающих. Методы. Пер. с анг. Под ред. М. Манк.
– М.: Мир. – 1990. – 406 с. (изложена методика культивирования эмбрионов млекопитающих).
13.Боженова А. Д. Применение культур фибробластов в современной биомедицине. Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием «Биология в высшей школе: актуальные вопросы науки, образования и междисциплинарной интеграции». Рязань, 11-12 апреля 2019 г./А.Д. Боженова, О.А. Царева, М.А. Рахманкина. – Рязань.: ОТС
иОП. – 2019. – 211 с. (описано использование культуры фибробластов для научных и медицинских целей).
14.Гудвин Б. Аналитическая физиология клеток и развивающихся организмов. Пер. с англ. Под ред. А.М. Жаботинского. – М.: Мир. – 1979. – 288 с. (рассмотрено влияние различных факторов на рост и размножение клеток).
15.Дромашко С. Е. Компьютерная видеомикроскопия в биологических исследованиях и образовании: пособие/С.Е. Дромашко, О.В. Квитко, Я.И. Шейко и [др.]. – Минск: Право и экономика. – 2020. – 80 с. (представлен материал о возможностях видеомикроскопии живых клеток в научных и биологических исследованиях).
16.Ляпун И.Н. Биологические аспекты безопасности клеточных культур in vitro/И.Я. Ляпун//https://doi.org./10.17116/molgen2021300313. (подробно рассмотрены меры безопасности при работе с культурами клеток).
17.Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Под ред. А.И. Карпищенко. – Санкт-Петербург: Интермедика. – 1999. – Том 2. – 656 с. (культивирование лимфоцитов крови, клеток из эмбриональных органов).
18.Пассарг Э. Наглядная генетика/Э. Пассарг; пер. с англ. Под ред. д-ра биол. наук Д. В. Ребрикова. – 2- изд (эл.). – 2021. – 508 с. (краткие схемы культивирования человеческих фибробластов, схема получения гибридных клеток).
19.Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Пер. с англ. Под ред. Л.И. Работновой. – М.: Мир. – 1978. – 333 с. (изложены условия, необходимые для культивирования микроорганизмов и клеток; рассмотрены вопросы размножения, роста и дифференцировки культивируемых клеток).
20.Поддержание жизнеспособности клеток на предметном стекле//https://stpormoff.ru/mediacenter/articles/article76/Дата обращения:
48
11.02.2024. (рассмотрены условия для визуализации живых культуральных клеток под световым микроскопом, перечень клеток культуры млекопитающих, которые наиболее подходят для изучения и проведения исследований).
21.Ченцов Ю.С. Общая цитология: Учебник. – 2-е изд. – М.: Изд-во Моск. Унта. – 1984. – 352 с. (дается сжатое описание метода культивирования клеток и тканей).
22.Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия [Электронный ресурс]/Р. Шмид; пер. с нем. – 2- изд. (эл.). – Электрон. Текстовые данные (1 файл pdf/327 с). – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2015. – 324 с. (использование метода культивирования клеток).
23.URL: https://f.eruditor.link/file/1673295. Дата обращения: 04.11.2024 г. (обширный список литературы по культивированию клеток и биотехнологии).
49
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК
учебно-методическое пособие
________________________________________
Подписано в печать 02.12.2024 г. Формат 60х84/16 Уч.-изд. л. 2,47. Бумага офисная. Печать-ризография. Тираж 300 экз.
_____________________________________________________________________________
Издательство ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет им. А.А. Кадырова» Адрес: 364037 Чеченская Республика, г. Грозный, ул. Субры Кишиевой, 33
50