Культивирование животных клеток. Учебно-методическое пособие

существуют типы клеток, которые могут делиться в культуре практически бесконечно, если поддерживать соответствующие условия для их развития. Примером поcледних является клеточная линия HeLa.

Культивирование клеток – метод извлечения (отделения) клеток от тканей и органов животного и их выращивание в питательной среде, в стеклянных или пластиковых емкостях (чашки Петри, флаконы), то есть in vitro (в пробирке) вне организма животного.

Первичная культура – рост отделенных от кусочка ткани клеток в питательной среде вплоть до заполнения ими подложки (например, дна чашки Петри или флакона) без промежутков (пространства) между растущими клетками.

Субкультура клеток и субкультивирование – перенос клеток из первичной культуры в новую среду (в новую чашку Петри, флакон) для дальнейшего их размножения и роста. Другие понятия, используемые для обозначения процесса субкультивирования – перевивание, пересев, пассаж.

Клеточная линия – после первого субкультивирования первичная культура клеток становится клеточной линией. Клетки, входящие в клеточную линию и первичную культуру, характеризуются тем, что они обладают генотипическим и фенотипическим разнообразием и наиболее выраженной способностью к росту.

Деформация клеток – подпополуляция клеток, выбранная из культуры путем клонирования, становится клеточным штаммом. Штамм приобретает дополнительные генетические изменения по сравнению с родительской клеткой.

Конечная и непрерывная клеточная линия – нормальные клеточные линии,

которые детерминированы на ограниченное количество делений и жизнь, которых завершается старением и гибелью, образуют конечную линию. Некоторые клеточные линии в результате трансформации могут становиться бессмертными. Такие клетки называют непрерывной клеточной линией. Трансформация (опухолевой перерождение) клеток может быть вызвана воздействием химических соединений, вирусов или вредных токсических факторов.

Кондиционированная питательная среда – смесь свежей и уже использованной культуральной среды. Во время культивирования клеток в питательную среду поступают продукты их активности, в частности, собственные факторы роста, оказывающие влияние на рост и дифференцировку культуральных клеток. Поэтому смесь из этой среды и порции новой свежей среды улучшают указанные параметры развития клеток культуры. Кондиционированная среда применяется в случае плохого роста культуры клеток или при низкой концентрации клеток в культуре.

Ламинар – отдельное техническое устройство для создания стерильных условий работы с культурами клеток. В ламинаре поддерживаются стерильные условия для манипуляций с культуральными клетками.

Бокс – отдельное, изолированное помещение, комната для размещения ламинара, оборудования и других предметов, Бокс служит для создания стерильных условий работы с клетками.

11

Подложка – твердая основа, поверхность дна чашки Петри, флакона или бутыли для адгезии и прикрепления культивируемых клеток. Покровные стекла, помещенные, например, в чашку Петри с культуральной средой также выполняют ту же функцию.

Антибиотики – фармакологические агенты для подавления роста бактерий в культуральной среде.

Микомиметики (антимикотики) – фармакологические средства угнетения роста грибов в среде культивирования.

Монослой – клетки, растущие на подложке (покровном стекле) в один слой. Клетки в составе монослоя хорошо распластаны и между ними практически отсутствует свободное пространство, например, когда они полностью заполняют поверхность дана чашки Петри, подложки. Одним из преимуществ монослоя клеток является то, что они хорошо прикрепляются к поверхности, например, покровного стекла, что позволяет проводить различные обработки клеток – перенос из одной среды (раствора) в другую, обработку клеток лизирующими смесями, фиксаторами или красителями. При этом клетки не отрываются от поверхности покровного стекла. Вот эти свойства позволяют использовать монослой на покровных стеклах при иммуноцитохимических исследованиях.

Термостат (СО2-инкубатор) – техническое устройство для поддержания постоянной температуры и газового состава, необходимых для нормального роста и развития культивируемых клеток. Термостат (СО2-инкубатор) должен содержать механизм или устройство для поддержания концентрации СО-2 и О2.

12

1.3 Характеристика клеточной линии

Клеточная линия – это культура клеток с преобладанием однородных клеток, для которых характерна высокая скорость роста. Ее получают из первичной культуры путем нескольких генерация, пассажей. Согласно Фрешни

(8) выделяют несколько этапов, которые нужно пройти, чтобы получить клеточную линию:

1.Выделение клеток из образцов ткани животного или человека. Этот этап позволяет выделить культуральные клетки из ткани экспланта (кусочка ткани животного). Для выделения клеток ткань разрушают механической или ферментативной обработкой. Существуют методики выделения клеток из каждого типа ткани животного;

2.Создание первичной культуры. Клетки, выделенные путем механической

иферментативной обработок, выселяются на подложки и формируют на ней первичную культуру. Примерно через 2 недели производят 1-е субкультивирование (1-й пассаж, пересев). Второе субкультивирование осуществляют примерно через 3 недели от начала срока получения 1-й культуры или через 1 неделю после 1-го субкультивирования. Дальнейшие пересевы можно производить через семь дней;

3.Формирование первой субкультуры. Клеточная линия характеризуется рядом признаков. Прежде всего, она является конечной (живет со всеми пересадками около 14 недель, потом линия стареет и погибает) или постоянной (трансформируется и живет неопределенно долго, то есть становится бессмертной клеточной линией). К числу других признаков относятся видовая принадлежность, скоростные характеристики роста, морфологические признаки, стабильность клеточной линии и ее готовность к эксплуатации. Пересаженную первичную культуру в дальнейшем называют клеточной линией. Важно заметить, что субкультивирование предполагает пересадку культивируемых клеток в новый флакон, с новой питательной средой;

4.Пассажи культуры клеток для поддержания клеточной линии. Пассажи производят через каждые 3-10 дней. Необходимо учитывать и регистрировать количество пассажей (пересевов). После пересева клетки делятся и растут. Количество удвоений клеток, которому подвергалась культура клеток, принимают за генерацию;

5.Старение или трансформация клеток культуры. С течением времени,

через определенной количество генераций (удвоений), клетки культуры стареют

инаступает их естественная гибель. Обычно, нормальные клетки могут давать 20-100 генераций, но в среднем старение клеток наступает приблизительно через 50 делений и после чего снижается их потенциал к делению и наступает смерть. В клеточной биологии введено понятие «Предел или лимит Хейфлика», которое указывает границу, когда наступают признаки старения и гибели клеток. Для человеческих клеток предел Хейфлика равен 50 делениям (генерациям);

6.Иммортализованные клеточные линии. Некоторые клеточные линии могут давать начало так называемым постоянным (иммортализованным)

13

клеточным линиям. Иммортализация может быть вызвана химическим воздействием или вирусами. Иммортализация может быть вызвана химическим воздействием или вирусами. Иммортализованные (постоянные) клеточные линии бывают анеуплоидными, то есть имеют промежуточный набор хромосом между диплоидными и тетраплоидным наборами хромосом.

Постоянные клеточные линии имеют свои специфические характеристики при культивировании. У них снижена потребность в сыворотке в составе питательной среды и они могут расти на полужидких средах. Снижаются ограничения на рост плотности клеток в культуральной среде. При исследованиях в определенных областях рекомендуется воспользоваться постоянными клеточными линиями, так ка они лучше охарактеризованы и отличаются повышенной достоверностью и сравнимостью результатов научных исследований.

Готовые сертифицированные клеточные линии можно приобрести. В частности, в РФ существует организация «Российская коллекция клеточных культур», которая функционирует с 1978 года. В ней имеется набор коллекция готовых клеточных культур. Адреса коллекций можно найти в Интернет.

Приводим некоторые из них: http://www.cytsp.rssi.ru/rkkk/rkkk_ru.htm; http://www.sevin.ru/collection/cells.html.

Адреса большого перечня банков клеточных культур приведен в источнике

(2, с. 84-85).

Химический состав питательных сред, растворов и реагентов, используемых при культивировании клеток и тканей дается в руководстве (1, 4, 8). Фирмы-производители указывают состав продаваемых ростовых (питательных) сред и других реагентов, используемых при культивировании клеток. Среды для культивирования и криоконсервации различных типов животных клеток можно найти по адресу: http://www.sartogosm.ru/credy_dlya_kultivirovaniya_mezenchimalnyh_stvolovyh_r ktnjr.html. В частности, фирма “SART”RIUS” предлагает для культивирования – синтетическую бессывороточную среду Thera PEAK “KGM-CD”, мезенхимальных стволовых клеток – синтетическую бессывороточную среду “MSCGM-CD”, фибробластов – синтетическую бессывороточную среду “FGMCD”.

Подробный обзор питательных сред для клеток млекопитающих и их характеристики приведены в статье (7). В этой же статье даются рекомендации по выбору ростовой среды для той или иной клеточной линии. В более ранних руководствах можно ознакомится с подробным составом сред, буферов и характеристиками реагентов, их приготовлением (1, 8).

Ниже мы приводим паспортные данные одной из клеточных линий человека и животных из коллекции СИФИБР СО РАН, взятые с сайта: http://www.sifibr.irk.ru/collection/human-animal.html. В таблице указаны паспортные данные клеточной линии фибробластов. Готовые клеточные линии можно купить.

14

Таблица 1

Клеточная линия фибробластов

В паспорте указаны названия клеточной линии, среды культивирования, а также процентное содержание сыворотки, концентрация СО2 и оптимальная температура культивирования. На эти данные можно опираться при выборе условий для культивировании например, фибробластов во время выполнения практических работ, рекомендуемых в настоящем пособии.

Фирма ООО «БиолоТ» (адрес сайта: http://www.biolot.ru/catalogue/ -

актуально на 13.10.2024 г.) предлагает широкий набор клеточных линий различных животных и человека (мышь, хомяк, свинья, человек и другие), которые можно приобретать штучно, во флаконах (единица расфасовки – флакон). Например, можно приобрести культуру фибробластов мыши, выдержавших несколько пассажей. Эта же фирма предлагает ростовые среды и другие реагенты. Более того, фирма предлагает услугу по наращиванию клеточной биомассы купленной культуры по вашему запросу.

Для проведения научных исследований можно приобрести у фирмпроизводителей, в частности, у фирмы ООО «Биолот» уже готовые сертифицированные культуры клеток, клеточные линии.

15

1.4 Метод культивирования клеток

Для культивирования клеток необходима питательная среда и сосуд (чашка Петри, флакон), в котором будут расти клетки. Питательная среда для культивирования клеток должна содержать аминокислоты, углеводы, витамины и минералы. Питательную среду либо готовит экспериментатор самостоятельно, либо приобретают готовую среду у фирм-производителей, специализирующихся на продаже реагентов для культивирования. В ростовой среде кроме указанных компонентов должны содержаться факторы роста и гормоны. Факторы роста и гормоны стимулируют рост культуральных клеток. Для культивирования клеток необходимо соблюдать газовый состав (СО2, О2) в окружении клеток. Кроме того, регулироваться должны физико-химические параметры питательной среды: рН, осмотическое давление, температура. Клетки могут расти во взвешенном состоянии в питательной среде. В таком случае культуру клеток называют суспензионной. Способность к росту в суспензионных культурах клеток выражена слабо. Рост большинства клеток зависит от прикрепления (анкоража). Культуру таких типов клеток называют адгезивной или монослойной.

Морфология клеток культуры выглядит разной в зависимости от того растут ли они в суспензии или прикрепленными. По внешнему виду и форме культуральные клетки делят на несколько категорий: фибробластические и эпителиальные. Фибробластические клетки имеют удлиненную форму с двумя (биполярную) или несколькими (многополярную) полюсами. Фибробластические клетки растут прикрепленными к подложке, например, к поверхности дна чашки Петри, флакона.

Эпителиальные клетки могут быть полигональными или сферическими по форме. Полигональные эпителиальные клетки растут, прикрепляясь к подложке, а сферические растут, главным образом, во взвешенном состоянии без прикрепления к субстрату. Полигональные клетки в культуре характеризуются регулярными размерами.

Клеточный состав культуры, полученной из тканей многоклеточных организмов, неоднороден. В культуре встречаются разнообразные по морфологии клетки. На различия в морфологии клеток влияет химический состав питательных сред. Среда определяет скорость размножения и степень выраженности дифференцировки клеток в культуре. Для клеток культуры, полученной из эмбриональных тканей, характерна более или менее выраженная дифференцировка. Клетки, полученные из тканей животных и человека, в культуре могут делиться только ограниченное количество циклов. После чего они стареют и погибают.

Клетки первичной культуры не являются полностью идентичными клеткам тканей животных, из которых они получены. Поэтому исследователь должен обратить внимание на эту особенность клеток культуры, выращенных in vitro, и не переносить полностью полученные данные на клетки in situ.

Для отделения клеток первичной культуры от подложки с целью дальнейшего субкультивирования их обрабатывают различными агентами. Для

16

этого в первичную культуру клеток добавляют новую среду, содержащий фермент-пептидазу трипсин. Кроме того, вновь добавляемая среда с ферментами не должна содержать ионы кальция Са2+ и Mg. В среду можно также добавить хелатирующие агенты. Последние снижают концентрацию ионов кальция и магния или удаляют их из питательной среды. Такой раствор или среда препятствует адгезии клеток первичной культуры к подложке и формированию межклеточных контактов между ними. В принципе, раствор или среда, добавляемые к первичной культуре похожи на те, которые используются для отделения клеток из кусочков тканей животных (эксплантов) при получении первичной культуры. Отличие состоит в том, что в раствор или среду для отделения клеток от тканей животного нужно добавлять фермент коллагеназу, который необходим для разрушения межклеточного матрикса тканей животного.

Важно заметить, что ферментативную обработку кусочков тканей животного при получении первичной культуры можно заменить механическим измельчением ткани ножницами. Клетки из измельченной ткани животного отделяются и прикрепляются к подложке в культуральной среде, формируя первичную культуру. После пассажа первичной культуры, часть клеточных типов из использованной ткани животных исчезает. Как правило, пересев хорошо переносят малодифференцированные клетки.

Многократное субкультивирование, путем пассажей первичной культуры (или клеток опухолей), дает возможность получить перевиваемую (конечную) культуру клеток или постоянную клеточную линию. Полученные таким образом культуры клеток или линии клеток можно использовать в лабораториях, нарастить их количество для дальнейших манипуляций и исследований.

17

1.5 Работа с клеточными культурами

Культивирование клеток невозможно без соблюдения стерильности. Это позволяет снизить риск бактериального или микробного заражения культуры клеток. Для сохранения стерильности условий в среду культивирования добавляют антибиотики или емкости (чашки Петри, флаконы) с культуральными клетками открывают в ламинаре, который должен находиться в отдельном боксе (помещении). Ламинар имеет рабочую поверхность, которую можно чистить, стерилизовать с помощью ультрафиолетовой лампы. При работе с патогенными культурами клеток экспериментатор отделен передним прозрачным стеклом ламинара от возможности контактирования с рабочей зоной ламинара. Это исключает вероятность заражения экспериментатора от образца, то есть потенциально патогенных клеток культуры.

Условия культивирования клеток определяются характеристиками подложки, составом питательной среды и газовой фазы. Культивируемые клетки прикрепляются к подложке (поверхности чашки Петри, флакона). Иногда в качестве подложки используют тонкие покровные стекла, помещаемые во флакон или в чашку Петри. Покровные стекла предварительно должны быть хорошо промыты и высушены. Перед использованием их также стерилизуют, путем термической обработки.

Покровные стекла перед использованием покрывают тонким слоем поли- L-лизина (желатина, фибронектина или коллагена). Это способствует хорошей адгезии и прикреплению клеток к поверхности покровного стекла.

Питательная или ростовая среда представляет собой многокомпонентную систему. Она должна содержать питательные вещества, неорганические соли и иметь высокую буферную емкость. Обычно, приготовления эмпирическим путем среда страдает отсутствием содержания белков, важных для процессов клеточного деления и дифференцировки культивируемых клеток. Для преодоления этого недостатка в среду вносят сыворотку плазмы крови (3-15 % сыворотка) животного. Сыворотку получают из крови быка, осла или лошади.

Для выполнения отдельных задач с культивируемыми клетками необходимым условием является использование сред с фиксированным компонентным составом. Такие среды получили название искусственных. Подбор компонентов искусственной среды требует более индивидуального подхода. В такую среду необходимо вводить достаточно дорогостоящие факторы роста и гормоны. Естественные среды, содержащие сыворотку, оказываются более доступными и способны обеспечить хороший рост клеток в культуре. Следует заметить, что структура подложки, химический состав среды влияет не только на пролиферацию (размножение, рост) клеток, способность к дифференцировке, но и оказывают влияние на морфофункциональные особенности и проявления тканеспецифических синтезов культивируемых клеток.

18

Существуют хорошо разработанные протоколы по культивированию некоторых типов клеток: пересадки СПЭВ, эмбриональных фибробластов, заморозки СПЭВ и прочих.

Чаще всего для культивирования клеток животных используют следующие среды: минимальная среда Игла (МЕМ), миниальная среда в модификации Дюльбекко (DMEM), среда 199, среда F-12, среда L-15 и другие. Эти среды приготовлены на основе сбалансированных буферных солевых растворов (раствор Эрла, раствор Хенкса). При необходимости можно узнать состав сред и буферных растворов в каталогах фирм-производителей. Адреса некоторых фирмпроизводителей можно найти в настоящем учебном пособии или на просторах Интернет. Хороший обзор по ростовым средам и сывороткам для культивирования клеток млекопитающих можно найти в статье (7). В этом же источнике даются рекомендации по подбору питательных сред для разных типов культивируемых клеток.

Криоконсервация клеток культуры. При длительных перерывах в работе с культурами клеток их можно заморозить и хранить при низких температурах (- 500С-700С). Замораживаемую культуру клеток сначала отделяют от подложки подобно тому, как это делают при субкультивировании первичной культуры. Получают суспензию клеток центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, то есть прежнюю среду культивирования. К осадку из клеток добавляют специальную среду для заморозки. Для правильной заморозки и разморозки клеток разработаны специальные протоколы, например, есть протокол для заморозки культуральных клеток СПЭВ. Подробнее метод криоконсервации рассмотрен в источнике (2) на страницах 65-67.

19

1.6 Условия для культивирования клеток

Работа с культурой клеток должна производиться в отдельном помещении или отдельной комнате. Так как основное требование при проведении работ с культурой клеток – это соблюдение асептических условий. Помещение или зону в лаборатории, где проводятся работы с культурой клеток называют боксом. Основные требования к боксу следующие:

1.Помещение бокса не должно иметь сквозных проходов;

2.В нем должно быть ограничено движение людей;

3.Он должен располагаться отдельно от микробиологической лаборатории, помещений, служащих для содержания животных;

4.В самом боксе должно быть выделено место, зона для выполнения работ, не требующих стерильности, например, получение кусочков ткани животного, механическая и ферментативная обработка полученных кусочков ткани животного;

5.Обязательно наличие в боксе моечной зоны;

6) Отдельная зона хранения лабораторной посуды из стекла и пластики, газовых баллонов, жидкостей и реагентов с возможностью поддержания комнатной температуры и температуры от -4 до -200С (холодильник);

7.Наличие отдельного помещения для стерилизации посуды и материалов;

8.Наличие ламинара для манипуляций с культурой в асептических условиях.

Обязательными для бокса являются следующие приборы: холодильник, СО2-инкубатор, ламинар (ламинарно-потоковый шкаф), инвертированный световой микроскоп, центрифуга.

Рассмотрим назначение и использование указанных приборов.

Влажный СО2-инкубатор нужен для поддержания и регулирования концентрации углекислого газа в вентилируемом внутри инкубатора воздухе и уровня влажности. Концентрация газов (СО1 и О2), значения температуры и уровень влажности контролируются датчиками самого инкубатора. Регулируемый диапазон содержания газов следующий: для СО2 – 0-20%, О2 – 0,2-95%. Для культуры клеток человека и теплокровных животных нормальными значениями являются следующие: концентрация углекислого газа 5% (5% СО2), влажность воздуха в инкубаторе составляет 70% и температура 370С.

Ламинарно-потоковый шкаф II-класса биологической безопасности. Ламинар имеет рабочую зону, в которой производятся работы с культуральными клетками (в чашках Петри, флаконах), средами и реагентами в стерильных условиях. При этом ламинар защищает самого оператора и окружающую среду от заражения, инфекции. Таким образом, ламинар предназначен для защиты рабочей зоны (место манипуляций с культурой клеток), оператора (отгорожен прозрачным стеклом от рабочей зоны ламинара), окружающей среды (инфекция не заносится в ламинар и не выносится из нее). Специальные НЕРА-фильтры спукают ламинарные потоки с верхней части ламинара на ее рабочую зону, столешницу. НЕРА-фильтр с высокой эффективностью (99,9%) очищает воздух,

20