Культивирование животных клеток. Учебно-методическое пособие

подаваемый в ламинар, от частиц размером до 0,3 мкм. Для обеззараживания микроорганизмов в ламинаре также имеется ультрафиолетовая лампа. Она обеззараживает внутренний объем (пространство) ламинара. Ультрафиолетовая лампа включается в ламинаре за 40 минут до начала работы, а также оставляется на 40 минут после работы.

Инвертированный световой микроскоп. Он обладает перевернутой конструкцией. В результате чего конденсор (направляет свет на образец) освещает образец (препарат, чашка Петри, флакон) сверху, а объективы микроскопа оказываются под изучаемым объектом, предметным столиком. Важно заметить, что оператор может помещать под микроскоп чашки Петри, флаконы с культивируемыми клетками на предметном столике микроскопа, чтобы оценить заполнения клетками пространство дана чашки Петри, флакона. С обычным световым микроскопом такие манипуляции затруднены. Инвертированные микроскопы, оснащенные системой фазового контраста, позволяют увидеть не только общую морфологию клеток, но и увидеть некоторые клеточные структуры (органеллы, веретено деления, реснички и пр.).

Центрифуга. С помощью центрифуги можно осаждать клетки в среде, растворе, увеличить их концентрацию, отделить надосадочную жидкость. Эти операции с центрифугой требуются при работе с клеточными культурами, в частности, при пассажах клеток. Обычно, центрифуга размещается в боксе, что облегчает доступ к нему при необходимости. Число оборотов у центрифуги, используемой при культивировании клеток, должно находиться в пределах от 200 до 4000 оборотов в минуту (об./мин). Для осаждения культуральных клеток во время пересева, обычно используют скорость 1000 об./мин. Рекомендуется использовать настольную центрифугу, которую можно поместить непосредственно в ламинаре, в асептические условия.

Холодильник. Он служит для хранения реактивов и растворов, используемых во время работы с культурой клеток. Холодильник должен поддерживать следующие диапазоны температурных режимов – от 00+ до +80С и -200С. Его также размещают в боксе.

Присутствие указанных приборов непосредственно в помещении бокса снижает вероятность заражения (контаминации) культуры клеток.

Кроме указанных выше приборов в подготовительной зоне бокса должны располагаться лабораторные столы, навесные полки для хранения расходных материалов, лабораторной посуды. В этой же зоне должно быть предусмотрено место для подготовки образцов ткани и приборы для приготовления реактивов. К таким дополнительным, к указанным выше приборам, относятся аналитические весы, шейкеры, магнитные мешалки и термостат.

Для стерилизации лабораторной посуды и материалов необходимо иметь отдельное помещение, в котором должны быть суховоздущный шкаф, вертикальный паровой стерилизатор, снабженный системой управления и отдельный шкаф для хранения материалов.

Культуральная посуда и реагенты. Для культивирования клеток используют стеклянную или пластиковую посуду. Главное требование к посуде

21

– это соблюдение стерильности. Стеклянная посуда служит для многоразового использования. Она требует мытья и стерилизации после каждого использования. В отличие от стеклянной посуды пластиковая является одноразовой и не требует мытья и стерилизации. После однократного использования пластиковая посуда выбрасывается. Однако, пластиковые наконечники автоматических пипеток могут быть использованы неоднократно и поэтому требуют стерилизации после каждого использования.

Для роста клеточных культур используют культуральные флаконы с площадью 25, 75, 150 или 225 см2. Кроме флаконов для обеспечения роста культуры клеток, проведения экспериментов, клонирования используют чашки Петри с разными диаметрами – 35, 60 и 90 миллиметров и луночные чаши, имеющие разное количество лунок – 6, 12, 24, 48, 96. Отбор жидкостей и растворов производят с помощью серологических пипеток и автоматических дозаторов.

Для центрифугирования используют центрифужные пробирки фалькон, с объемом 15 и 50 мл. Для хранения реактивов при низких температурах до -200С, отбора жидкостей или растворов во время манипуляций с культурами клеток используют пробирки Эппендорфа разного объема – 0,5, 1,5 и 2 мл. Для хранения пробирок Эппендорфа используют контейнер. Для каждого типа пробирок подбирают соответствующий тип контейнера.

Для хранения наконечников пипеток и дозаторов используют также специальные контейнеры, которые должны соответствовать типу наконечника. Эти контейнеры предназначены для хранения наконечников в асептических условиях. Для каждого типа пробирок при работе в ламинарном шкафу требуются пластиковые (лабораторные) подставки.

Кроме перечисленных видов пробирок используются пробирки для замораживания клеток, так называемые криопробирки объемом 0,5, 1,5 и 2 мл. Помещенные в такие пробирки культивируемые клетки помещают для хранения в криохранилище.

Есть приборы, предназначенные для получения сверхчистой воды. Для получения чистой воды используют установки ОВ-1, ОВ-2 и ОВ-3. Сверхчистая вода в дальнейшем используется для приготовления питательных сред для клеток и тканей, мытья (ополаскивания) лабораторной посуды, которую будут использовать для выращивания культуральных клеток и тканей.

Средства для подсчета концентрации культуральных клеток. При культивировании клеток возникает необходимость расчета концентрации клеток, которые нужно высадить в культуральную посуду при создании первичной культуры или при последующих пересевах. Для подсчета клеток используется камера Горяева. Она позволяет подсчитать количество клеток в определенном объеме жидкости, среды. Устройство камеры Горяева (цитометра) и правила работы с ней приводится в практических руководствах по физиологии и гематологии. Также можно посмотреть правила работы с камерой Горяева и в учебно-методическом пособии (9), которое указано в списке литературы данного пособия.

22

Приборы и материалы ламинарного шкафа и правила работы с ними. Для повседневной работы с культурами клеток в ламнаре обязательно должен находиться следующий перечень материалов и приборов на постоянной основе: контейнеры с наконечниками для дозаторов и пипеток, дозаторы, пипетки, пинцет. В ламинаре обязательно должна стоять емкость с 70% этиловым спиртом и контейнеры с ватными тампонами. Спирт используется для протирки поверхности приборов и столешницы ламинара. Кроме того, в ламинаре должна стоять спиртовая горелка. С помощью ватных тампонов, смоченных 70% этиловым спиртом, необходимо протирать предметы, вносимые извне в ламинар. Края сосудов, которые открываются и закрываются в ламинарном шкафу, должны быть протерты и дополнительно прокаливаться в пламени спиртовой горелки.

Для отбора необходимого (дозированного) количества и разведения биологических жидкостей, используемых при культивировании, используют

полуавтоматические пипетки и дозаторы. Обычно, единичная доза биологической жидкости, которую отбирают, находится в пределах от 1 микролитра (мкл) до 10 миллилитров (мл). Пипетки лабораторные ПЛ-01-20 позволяют отбирать дозы в диапазоне от 2 мкл до 20 мкл, с погрешностью ±0,2 мкл и сходиостью дозирования ±0,4 мкл. Обычно в поставляемый набор входят трех видов пипеток: ПЛ-01-20; ПЛ-01-200 (величина отбираемой дозы от 20 до 200 мкл, погрешность - ±1 мкл, сходимость - ±2 мкл); ПЛ-01-1000 (величина дозы

– от 200 до 1000 мкл, погрешность - ±5, сходимость дозирования при повторных отборах - ±10 мкл).

Автоматические дозаторы бывают с постоянным и переменным объемом. Чаще всего используют дозаторы с объемом 0,2, 1,0, 5,0 и 10 мл (миллилитров). Рекомендуемая верхняя граница пипетка 25 мл, то есть можно производить отбор жидкости и раствора до 25 мл.

У пипеток имеются сменные наконечники («носики»). Сама контсрукция технического устройства пипетки исключает возможность контакта и загрязнения отбираемой жидкости с деталями, рабочими элементами пипетки. Наконечники являются сменными и их можно использовать повторно, если отмыть, подвергнуть стерилизации при 1100С.

Дозаторы пипеточного типа для полуавтоматического дозирования биологических жидкостей – это комплект дозаторов пипеточных типов КДП. Дозаторы (пипетки) различаются по цвету, то есть имеют цветную маркировку. С дозаторами в комплекте имеются сменные наконечники. Имеется 8 моделей указанного типа дозатора. Каждая модель позволяет отбирать две фиксированные дозы – 5 и 10, 20 и 25 и 75, 50 и 100, 75 и 150, 200 и 300, 250 – 300, 600 и 1000 мкл.

Полная ростовая среда для культивирования. Полная ростовая среда – это питательная среда, которая содержит все необходимые компоненты для культивирования клеток. Полную ростовую среду готовят из среды определенного состава, куда дополнительно вносят аминокислоту (глутамин), ростовые факторы, гормоны, антибиотики, антимикотики и сыворотку. В

23

качестве среды определенного состава чаще всего используют среду Игла (МЕМ). Именно среду Игла используют в качестве основы для множества полных готовых сред.

Среда Игла содержит набор незаменимых аминокислот (тирозин, цистеин, аргинин, цистин), группу витаминов (никотинамид, витамины группы В, фолиевая кислота, биотин, инозитол, холин). Кроме того, в составе среды Игла содержатся различные соли (РО2-, SO42-, Cl-, HSO3-, K+, Ca2+, Mg2+). Na+, K+ и Cl-

важны для поддержания мембранного потенциала, а HSO3-, SO42-, PO42- - участвуют в регуляции заряда внутри культивируемых клеток. Все вместе – анионы и катионы – регулируют осмотическое давление клетки. Источником энергии для клеток культуры служит глюкоза, которую добавляют в ростовую среду. Метаболизм глюкозы в клетках культуры происходит анаэробно, то есть путем гликолиза.

Среды определенного состава, являющиеся основой приготовления полных сред, могут и не содержать аминокислоту глутамин. Ее необходимо дополнительно вводить в ростовую среду. Для некоторых культур может потребоваться повышенное содержание аминокислот, тогда их дополнительно вносят в питательную среду.

Сыворотка. Для нормального роста и дифференцировки клеток культуры требуется еще ряд дополнительных компонентов, которых нет в составе исходной минимальной среды Игла. Эта проблема решается добавлением в приготовляемую полную среду некоторого количества сыворотки. Сыворотка содержит ингредиенты, которых нет в среде Игла: пептиды, белки и гормоны. Пептиды представлены ростовыми факторами, например, тромбоцитарным фактором роста (PDGF или ТРФ), эпидермальным фактором роста (ECF), фактором роста фибробластов (FGF). Ростовые факторы влияют на скорость роста и дифференцировку клеток культуры. Факторы роста различаются по специфичности действия на клетки. Среди белков сыворотки присутствуют альбумин, фибронектин, макроглобулины и еще ряд не охарактеризованных белков. Фибронектин необходим для адгезии культуральных клеток, альбумины выступают в качестве переносчиков минералов и липидных молекул. Макроглобулины участвуют в ингибировании энзима трипсина, а трансферрин помогает клеткам усваивать железо. Питательные компоненты сыворотки представлены неорганическими солями, витаминами и жирными кислотами.

Гормоны сыворотки. Гормональные компоненты сыворотки в питательной среде регулируют транспортные процессы через плазматическую мембрану культивируемых клеток, оказывают влияние на рецепторный аппарат плазмалеммы и фенотип клетки. В сыворотке присутствуют ряд важных для жизнедеятельности клеток гормонов: трийодтиронин, гидрокортизон, инсулин, эстрогены.

Антибиотики и антимикотики. При работе с культурами сохраняется высокая вероятность заражения бактериями и грибами. Эта опасность присутствует даже при соблюдении асептических требований при работе ламинарно-потоковом шкафу. Поэтому для избежания заражения (контаминации)

24

в ростовую среду добавляет антимикотики (против грибов) и антибиотики (против бактерий). В то же время строгое соблюдение асептических условий культивирования позволяет отказаться от использования средств контаминации

(9). При рутинных процедурах с культуральными клетками использование указанных средств может быть даже вредным, поэтому желательно избегать их использование в работе.

Препараты для снятия культуральных клеток с подложки. При культивировании клеток возникает необходимость снять прикрепленные к подложки (поверхности дна чашки Петри, флакона) клеток, формирующих монослой. Это необходимо при субкультивировании клеток первичной культуры, а также при последующих пересевах. Прикрепление клеток культуры происходит за счет формирования ионных и пептидных связей. Для разрушения пептидных связей используют 0,25% раствор трипсина, а ионные – разрушают с использованием раствора Версена.

Перед применением препаратов для снятия культуральных клеток их предварительно нужно отмыть от основной среды, в которой они росли. Полагают, что это освобождает клетки от макроглобулинов, вносимых в питательную среду вместе с сывороткой. Макроглобулины могут ингибировать трипсин. Для освобождения клеточной культуры от основной ростовой среды используют фосфатно-солевой буфер (PBS) и раствор Хенкса. После отмывки от среды в культуральную посуду (чашка Петри, флакон) вносят раствор Версена и трипсин.

Субкультивирование адгезивной первичной культуры клеток. Известно,

что культививрование клеток можно проводить во взвешенном, так и прикрепленном (адгезивном) состоянии. Прикрепленные культуры формируют монослой из клеток. Они прикреплены к поверхности стекла или пластика с помощью белков плазматической мембраны клеток: молекул адгезии, протегликанов и интегринов. Во время выращивания культуральных клеток используют, например, пластиковые или стеклянные флаконы. Внутренние поверхности такой посуды обладают шероховатой поверхностью и она дополнительно обрабатывается специальными агентами. Это способствует лучшей адгезии клеток к поверхности флакона. В качестве адгезивных агентов используют коллаген.

Следует заметить, чтобы сформировать трехмерную структуру будущей ткани животного стали использовать искусственные или естественные скаффолды (носители, подмостки). Такие подмостки могут заполняться культуральными клетками, формируя ткань или орган.

Не вдаваясь в подробности получения первичной культуры (см. ниже), рассмотрим суть метода субкультивирования, пересева клеток. На определенном этапе развития первичной культуры наступает момент, когда культуральные клетки в посуде заполняют всю поверхность дна, например, флакона или чашки Петри. При этом в сформированном монослое клеток дальнейшее деление клеток становиться невозможным, так как между ними возникает контактное торможение. Более того, при длительном культивировании могут накапливаться

25

ошибки и культура клеток начинает проявлять признаки старения. Поэтому возникает необходимость пересадки таких клеток (часть из них) в новую посуду с новой питательной средой. Для этого нужно разрушить связи между самими клетками культуры, оторвать их от поверхности (подложки) флакона или чашки Петри.

Процесс субкультивирования (пересева, пассажа) включает несколько последовательных шагов:

а) удаление старой питательной среды культивирования; б) отделение культуральных клеток от поверхности подложки и нарушение

контактов между соседними клетками монослоя с помощью воздействия энзима трипсина. Дополнительное встряхивание сосуда (флакона, чашки Петри) с клеточной культурой способствует разделению (диссоциации) клеток;

в) разведение диссоциированных клеток в новой свежей порции среды; г) подсчет концентрации клеток в флаконе с помощью камеры Горяева; д)

пересадка клеток в новую чашку Петри или новый флакон с питательной средой с учетом концентрации.

Культивирование эмбриональных стадий млекопитающих. Часто возникает необходимость использования для исследований ранних эмбриональных стадий развития млекопитающих, культивируемых in vitro. Подробно метод культивирования описан в руководстве (12). В этом руководстве приводится состав сред и условия культивирования эмбрионов млекопитающих вплоть до стадии бластоцисты in vitro, начиная с ранних стадий. В то же время в некоторых работах использован подход, когда культивирование эмбрионов мышей производится непродолжительное время на определенных стадиях раннего развития (11). При этом эмбрионы, например, мыши, развивающиеся in situ (на месте) извлекаются из беременной самки мыши на определенных стадиях развития (стадиях дробления) в соответствии задачами исследователя. Помещают ранние эмбрионы в среду культивирования, например, в чашки Петри или часовые стекла, покрытые силиконом. Далее эти эмбрионы можно прикреплять к покровным стеклам в специально изготовленных камерах с помощью центрифугирования. Эмбрионы мыши, прикрепленные к покровному стеклу можно использовать для иммуноцитохимического окрашивания или элктронномикроскопического исследования. Таким образом, при таком подходе можно изучать морфологические и молекулярные изменения в бластомерах морулах, бластоцистах, развивающихся непосредственно в организме животного, in situ.

В цитогенетике, в науке изучающем структуру и функции хромосом, используется метод кратковременного культивирования клеток. Для цитогенетических исследований культуральные клетки могут быть использованы для изготовления препаратов хромосом. Одним из простых и доступных методов в цитогенетике является метод культивирования лимфоцитов периферической крови. В периферической крови дифференцированные лимфоциты не способны к митотическому делению. Но для цитогенетических исследований необходимо получать препараты митотических хромосом. Поэтому

26

лимфоциты помещают в культуральную среду, в которую вводят митогены (конковалин А, фитогемааглютинин (ФГА), покивид). Митогены инициируют митоз в лимфоцитах. Для культивирования лимфоцитов можно взять кровь из пальца руки. Методика культивирования лимфоцитов периферической крови и способы получения митотических хромосом лимфоцитов подробно описаны в руководстве (17, том 2) на страницах 550-551. В этом же руководстве приведены методы кратковременного культивирования клеток хориона и плаценты для цитогенетических исследований на страницах 551-553. Хромосомный анализ можно проводить и на длительно культивируемых клетках монослоя. Клетки для длительного культивирования можно получать их других эмбриональных органов животных. Методики описаны в указанном выше руководстве на страницах 553-555. Длительное культивирование клеток в монослое представляет собой сложную технологию. Она требует дорогого оборудования, специальное обособленное помещение и набор целого ряда химических реагентов. Часто для длительного культивирования используют эмбриональные фибробласты. Для получения фибробластов используют биоптаты (кусочки) кожи, оболочки плода и амниотическую жидкость. На страницах 554 -555 из указанного выше справочного руководства приводится методика получения монослоя из эмбриональных фибробластов и хромосомных препаратов из них. Подробнее о методе культивирования эмбриональных фибробластов говорится ниже.

В руководстве (17, том 2) на странице 562 описан метод гибридизации in situ. Метод основан на связывании молекулы ДНК хромосом с фрагментами молекул ДНК и РНК, то есть с так называемыми «зондами». Связывание ДНК- и РНК-зондов происходит непосредственно на фиксированных препаратах интерфазных ядер или митотических хромосом культивируемых клеток. Метод позволяет точно локализовать местоположение любой последовательности РНК и ДНК в ядре культивируемых клеток.

Клонирование клеток. Целью клонирования является получение потомства одной единственной клетки. Для этого используют постоянные клеточные линии, не конечные. У последних имеются ограничения на количество генераций. Они быстро стареют и погибают.

Для клонирования клеток, например, постоянной культуры клеток необходимо провести максимальное разведение клеточной культуры в ростовой среде. Высадить клетки в чашку Петри со средой. Добиться того, чтобы на подложке оказались единичные клетки со свободными пространством вокруг них. После того, как эти единичные клетки пролиферируют и дают некоторое количество клетокпотомков, избирательно извлекают их и высаживают в новый флакон с новой ростовой средой. Для улучшения роста клеток ростовую среду необходимо обогатить. Это первый способ получения клонов клеток.

Второй способ. Можно бесконечно разведенную культуру клеток постоянной клеточной линии поместить в чашки с ячейками (лунками) и тогда в отдельной ячейке может оказаться одна единственная клетка, которая даст потомков, то есть чистый клон. Дальнейшие шаги должны быть направлены на увеличение количества клонированных клеток. Подробно метод клонирования описан в руководстве для клеточных биологов (2) на страницах 67-69.

27

ГЛАВА 2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Занятие 1. Бокс, ламинарный шкаф, оборудование, посуда, среды и реагенты для культивирования клеток.

Цель занятия: Ознакомление с оборудованием, средами и посудой, необходимыми для культивирования животных клеток.

1.1 Ознакомиться с боксом (если таковой уже имеется) или лабораторией, в которых планируются работы по культивированию животных клеток. Обратите внимание на порядок расположения оборудования, размещения ламинара и лабораторной посуды в помещении бокса или лаборатории. В боксе, как правило, имеется верхняя УФ-лампа для облучения и дезинфекции помещения.

Рис. 1. Бокс – помещение для проведения работ по культивированию клеток. Видны: верхняя УФ-лампа, ламинар и СО2-инкубатор

.

Подробно о рекомендациях размещения оборудования, посуды и реагентов в боксе смотрите в теоретической части данного учебного пособия и в рекомендуемых в списке литературе источниках. В частности, с правилами работы в боксе и ламинарном шкафу можно ознакомится в руководствах (2, 9).

1.2 Ознакомится с устройством ламинара (ламинарного шкафа) и с правилами работы в нем. На рисунках 2, 3 показаны общий вид ламинара и схема расположения в нем предметов.

28

Рис.2. Ламинар с вертикальным (или горизонтальным) током воздуха

Поддержание стерильных условий при работе с культурами клеток и тканей. Освоить принципы работы ламинара и правила работы в нем.

Рис.3. Расположение предметов в ламинаре: 1- полностью стерильная зона, в которой нужно размещать поднос, 2 – неполная среда DMEM, 3 – сыворотка плодов коровы, 4 - нестерильная зона, в которой можно размещать нестерильные объекты, 5 – шприц на 10 мл, 6 – шприц на 1 мл, 7 – пипетки Пастера, 8 – шприцевая фильтр-насадка, 9 – флаконы с клеточной культурой, 10 – полная среда, 11 – спирт, 12 – шпатель для снятия клеток, 13 – наконечники для автоматических пипеток, 14 – стакан для слива старой среды.

29

1.2Ознакомьтесь с перечнем оборудования и посудой для культивирования клеток и их назначением, ориентируясь по рисункам.

Рис.4. СО2-инкубатор СО2-инкубатор необходим для поддержания газового состава и

температурного режима для культивирования клеток. Ознакомиться с принципами работы с СО2-инкубатором.

Рис. 5. Инвертированный световой микроскоп

30