Биотехнология. Учебно-методическое пособие для проведения лабораторных занятий

ченный основной раствор азотнокислого серебра разбавляют водой в отноше-

нии 1 : 100.

18.Растворы Нейссера для окрашивания волютина: раствор А: 1 г метиленового синего растворяют в 20 мл 96 %-го этанола, затем добавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты и 1 л дистиллированной воды. Раствор Б: 1 г кристаллического фиолетового растворяют в 10 мл 96 %-го этанола и дистиллированной водой доводят объем раствора до 300 мл. Раствор В: 1 г хризоидина

в300 мл горячей дистиллированной воды.

19.Фуксиновый раствор Пфайффера: 1 мл карболового фуксина Циля смешивают с 9 мл дистиллированной воды. Раствор не подлежит хранению, готовить непосредственно перед использованием.

20.Индоловый реактив для изучения продуктов белкового разложения: раствор А : 4 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в 30 мл этанола и добавляют 80 мл концентрированной соляной кислоты; раствор Б : насыщенный раствор K2SO4. Смесь обоих растворов в отношении 1 : 1 (5 : 5 мл добавляют к 20…30 мл субстрата) окрашивает индолсодержащий субстрат в красный цвет.

21.Реактив Шиффа: 1 мг измельченного фуксина растворяют в 200 мл дистиллированной воды, раствор фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат охлаждают до 30 °С и добавляют к нему 40 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Затем в склянку из темного стекла емкостью 500 мл вносят 1 г кислого сернистокислого натрия (NaHSO3) и вливают раствор фуксина. Обычно в течение суток раствор становится совершенно бесцветным или бледно-желтым. Раствор хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой.

22.Краситель судан III для определения жиров: 0,5 г краски судан III растворяют в 100 мл этанола или концентрированной молочной кислоты.

23.Тушь для окрашивания капсул: поступающую в продажу тушь разбавляют дистиллированной водой в отношении 1 : 9, полученный раствор стерилизуют 30 минут при 1 атм. Приготовленный раствор туши отстаивают в течение двух недель. Для окрашивания препарата всегда берут раствор из верхнего слоя жидкости, стараясь при этом не взбалтывать осадок.

24.Водный раствор метиленового синего: 1 мл концентрированного раствора метиленового синего добавляют к 40 мл дистиллированной воды. Для

51

окрашивания обычно используют этот раствор, который не подлежит длительному хранению и готовится непосредственно перед использованием. В разведении 1 : 10 раствор применяют для окрашивания микрофлоры.

25.Основной карболовый фуксин Циля: к 100 мл 5 %-го водного раствора фенола добавляют 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина. Смесь отстаивают в течение двух суток, затем фильтруют через бумажный фильтр. Готовый краситель можно хранить длительное время.

26.Окрашивание клеточной оболочки грибов методом Гутштейна: фиксированный препарат помещают в 5 % водный раствор танина на 20…30 мин, промывают водой и окрашивают карболфуксином (фуксин, карболовая кислота, этиловый спирт, вода в соотношении 1 : 5 : 10 : 100) в течение 1…2 мин. После тщательного промывания оболочка окрашивается в интенсивно красный цвет.

27.Витальная окраска грибов: при окрашивании препарата 0,02 % раствором нейтрального красного вакуоли приобретают розовую окраску, а гранулы метахроматина – ярко-красную.

28.Дифференциальное окрашивание содержимого гиф грибов: смесь состоит из красителей судана III, хлопчатобумажного синего и йода в молочной кислоте, в соотношении 1 : 1 : 1. В гифах жир окрашивается в ярко-оранжевый цвет, гликоген – в бурый, а протоплазма в синий.

29.Окрашивание пектиновых веществ: в фиксированный препарат добавляют несколько капель 0,5 % раствора сафранина в 0,6 % уксусной кислоте. Пектиновые вещества окрашиваются в оранжевый цвет.

52

Приложение 2

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

1.Агар с почвенной вытяжкой по Бант-Ровира для культивирования поч-

венных бактерий: К2НРО4 – 0,4 г; (NH4)2HPO4 – 0,5 г; MgSO4∙7H2O – 0,05 г; MgCl2 – 0,1 г; FeCl3 – 0,01 г; СаС12 – 0,1 г; пептон – 1 г; дрожжевая вытяжка –

1 г; почвенная вытяжка – 250 мл; водопроводная вода – 750 мл. Для получения почвенной вытяжки к 1 кг садовой почвы добавляют 1 л воды и стерилизуют 15 минут при 1 атм; после стерилизации смесь фильтруют через бумажный фильтр.

2.Картофельный агар по Красильникову (универсальная среда для большинства грибов и бактерий): 500 г очищенного и измельченного картофеля заливают 500 мл водопроводной воды и 15…20 часов выдерживают при комнатной температуре или кипятят 30 минут. Затем объем картофельного отвара доводят до 1000 мл, фильтруют через марлю и добавляют 20 г агара.

3.Картофельный агар для культивирования актиномицетов: глюкоза – 20 г; агар – 18 г; протертый картофель – 200 г; дистиллированная вода – 1000 мл.

4.Картофельно-декстрозный агар для культивирования почвенных грибов: измельченный картофель – 200 г; глюкоза – 20 г; дистиллированная вода – 1000 мл; агар – 17 г. Ломтики картофеля варят в 500 мл воды 40 минут. Агар также растворяют в 500 мл воды. Объем отфильтрованного картофельного отвара доводят до 500 мл и вместе с глюкозой сливают с раствором агара. После стерилизации, еще до застывания агара (при 45…50 °С), в питательную среду добавляют 100 мг/л тетрациклина.

5.Агар Чапека – Докса (универсальная среда): сахароза – 30 г; NaNO3 –

2 г; К2НРО4 – 1 г; MgSO4∙7H2O – 0,5 г; КС1 – 0,5 г; FeSO4∙7H2O – 0,01 г; агар –

20 г; дистиллированная вода – 1000 мл. Реакцию питательной среды устанавли-

вают с учетом оптимальных условий для данного микроорганизма. Для культивирования грибов наиболее пригодна среда с рН 4, а для бактерий и актиномицетов – с рН 7,2. Стерилизуют питательную среду 30 минут при 0,5 атм.

6. Дрожжевой автолизат: 200 г прессованных дрожжей растворяют в 1 л воды, вносят 2 г Na2HPO4 и при помощи 1 н. раствора NaOH устанавливают рН

53

суспензии на уровне 6,1. Затем добавляют 5 мл хлороформа и смесь отстаивают 48 часов при 37 °С. Добавлением 0,1 н. раствора NaOH доводят рН до 7,4, переносят ее в котел Коха и кипятят 30 минут при 100 °С. После охлаждения суспензию фильтруют через бумажный фильтр и 30 минут стерилизуют при 0,5 атм.

7.Дрожжевая вытяжка: 1 кг прессованных дрожжей взбалтывают в 1 л воды и в течение часа подвергают термообработке в котле Коха. Образовавшуюся массу трижды фильтруют через бумажный фильтр и затем в течение 30 минут стерилизуют при 0,5 атм.

8.Питательная среда Пошона для аэробных целлюлозоразлагающих мик-

роорганизмов: К2НРО4 – 1 г; СаС12 – 0,1 г; MnSO4 – 0,3 г; NaCl – 0,1 г; FeCl3 –

0,1 г; NaOH – 2,5 г; дистиллированная вода – 1000 мл.

9.Питательная среда Федорова для аэробных пектинолитических микроорганизмов: (NH4)2SO4 – 0,5 г; К2НРО4 – 0,5 г; водопроводная вода – 1000 мл. На поверхность жидкой питательной среды, налитой в колбы тонким слоем, укладывают также тонкий слой нестерильной размолотой льняной соломки.

10.Питательная среда Пошона для анаэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов: (NH4)2SO4 – 1,5 г; К2НРО4 – 1 г; MgSO4∙7H2O – 0,5 г; NaCl – 0,02 г; СаСО3 – 5 г; ZnSO4 — следовые количества; дистиллированная вода – 1000 мл; полоски фильтровальной бумаги.

11.Питательная среда Пошона для анаэробных азотфиксирующих бактерий: к 950 мл дистиллированной воды добавляют 0,75 г К2НРО4, 33 мл 0,1 н. NaOH, 50 мл раствора Виноградского [К2НРО4 – 5 г; MgSO4∙7H2O – 2,5 г; NaCl – 2,5 г; MnSO4 – 0,05 г; Fe2(SO4)3 – 0,05 г; дистиллированная вода – 1000 мл;

рН 7,2], 0,05 г СаСО3, 10 г глюкозы.

12.Агар Эшби для культивирования аэробных азотфиксирующих бакте-

рий: маннит – 20 г; К2НРО4 – 0,2 г; MgSO4∙7H2O – 0,2 г; NaCl – 0,2 г; K2SO4 –

0,1 г; СаСОз – 5 г; агар – 20 г; дистиллированная вода – 1000 мл.

13. Бобовый агар для культивирования клубеньковых бактерий: в 1000 мл водопроводной воды при комнатной температуре в течение 24 часов вымачивают 50 г белых бобов, затем воду нагревают и бобы кипятят 15 минут. Отвар пропускают через фильтр, доливают воду до 1 л, добавляют 10 г маннита и 20 г агара; рН 7,2.

54

14.Галактозный агар для культивирования пектинолитических бактерий: КН2РО4 – 1 г; MgSO4∙7H2O – 0,25 г; галактоза – 10 г; пептон – 5 г; СаСОз – следовые количества; агар – 15 г; дистиллированная вода – 1000 мл.

15.Глицерин-аспарагиновый агар для культивирования актиномицетов: глицерин – 10 мл; К2НРО4 –1 г; аспарагинат натрия – 1 г; СаСОз – 3 г; агар – 15 г; дистиллированная вода – 1000 мл; рН около 7,0.

16.Глюкозо-аспарагиновый агар для изучения актиномицетов: глюкоза – 10 г; аспарагин – 0,5 г; К2НРО4 – 0,5 г; агар – 15 г; дистиллированная вода –

1000.

17.Агар Хагема для микоризных грибов: солодовый экстракт – 5 г; глюко-

за – 5 г; NH4C1 – 0,5 г; КН2РО4 – 0,5 г; MgSO4∙7H2O – 0,5 г; 1 %-й раствор

FeCl3 – 0,5 мл; агар – 15 г; дистиллированная вода – 1000 мл.

18.Питательный раствор Гельригеля для выращивания стерильных культур растений: Ca(NO3)2 (безводный) – 0,492 г; КН2РО4 – 0,136 г; MgSO4 (безводный) – 0,06 г; КС1 – 0,075 г; FeCl3 – 0,025 г; дистиллированная вода – 1000 мл.

19.Мясо-пептонный бульон (универсальная среда для бактерий): 500 г свежей, нежирной говядины измельчают ножом или пропускают через мясорубку, добавляют 1 л водопроводной воды и отстаивают при комнатной температуре 12 часов. Затем мясо отжимают через марлю, полученный экстракт кипятят 30 минут и выпавшие в осадок белки отделяют фильтрованием. Доливая водопроводную воду, объем фильтрата доводят до 1 л, затем вносят 1 % пептона и 0,5 % поваренной соли. Для ускорения растворения пептона жидкость подогревают. Добавлением 0,1 н. раствора NaOH доводят рН раствора до 7. После этого питательную среду вновь кипятят 30 минут и затем фильтруют. Приготовленный таким образом бульон используют в жидком состоянии, а добавляя агар или желатин, из него получают плотную питательную среду, которую стерилизуют в автоклаве 20…25 минут при 1 атм.

20.Казеино-глюкозный агар Йенсена для культивирования актиномицетов: глюкоза – 2 г; казеин – 0,2 г (предварительно растворяют в 10 мл 0,1 н. раствора

NaOH); К2НРО4 – 0,5 г; MgSO4∙7H2O – 0,2 г; FeCl3∙6H2O – следовые количества;

дистиллированная вода – 1000 мл; агар – 15 г; рН 6,6.

55

21.Капустный агар для эпифитных микроорганизмов: 200 г мелконарезанной капусты заливают таким же количеством воды, настаивают несколько часов и затем фильтруют (к отвару можно добавлять 5 г солодовой вытяжки

и2,5 г кукурузного экстракта). Для нейтрализации кислот к фильтрату добавляют 1 % СаСО3, а затем 20 г агара. Стерилизуют 20 минут при 1 атм.

22.Раствор Кнопа для выращивания стерильных растительных культур: Ca(NO3)2 (безводный) – 1 г; КН2РО4 – 0,25 г; MgSO4 (безводный) – 0,25 г; КС1 – 0,12 г; FeCl3 – 0,012 г; дистиллированная вода – 1000 мл.

23.Солодовая питательная среда: проращенное и высушенное зерно пивоваренных сортов злаков размалывают, к 250 г полученной муки добавляют литр водопроводной воды и смесь выдерживают на водяной бане при 57 °C в течение двух часов. Степень гидролизации крахмала проверяют тестированием йода. Полученную массу фильтруют и измеряют удельную массу фильтрата при помощи ареометра Боллинга, деления шкалы которого соответствуют процентному содержанию сахара в растворе. Для культивирования грибов содержание сахара в питательной среде доводят до 3…4 %, для дрожжей – до 6…8 %, а для молочнокислых бактерий – до 10…20 %.

24.Агар на сенном отваре для исследования эпифитных микроорганизмов: 40…50 г измельченного клеверного сена 10 минут кипятят в 1 л водопроводной воды, затем фильтруют, доводят объем до 1 л, добавляют 15…2 г агара, полученную среду стерилизуют 30 минут при 1 атм.

25.Антибиотическая питательная среда Викерхэма для культивирования грибов: пептон – 3 г; глюкоза – 2 г; сахароза – 30 г; дрожжевой экстракт – 2 г; кукурузный экстракт – 5 г; NaNO3 – 2 г; К2НРО4∙ЗН2О – 1 г; КС1 – 0,2 г; FeSO4∙7H2O – 0,01 г; агар – 20 г; дистиллированная вода – 1000 мл; рН 7,0.

26.Состав среды Мурасиге-Скуга мг/л: NH4NO3 – 1650; KNO3 – 1900; CaCl2 2H2O – 440; MgSO4 7H2O – 370; KH2PO4 – 170; H3BO3 – 6,2; MnSO4 4H2O – 22,3; CoCl2 6H2O – 0,025; CuSO4 5H2O – 0,025; ZnSO4 7H2O – 8,6; NaMoO4 7H2O – 0,25; KI – 0,83; FeSO4 7H2O – 27,8; Na2ЭДТА – 37,3; Тиаминхлорид – 0,2; Пири-

доксин хлорид – 0,5; Никотиновая кислота – 0,5; Аскорбиновая кислота – 1,5; Мезоинозит – 100. Сахароза – 30 г/л; Агар – агар 7 г/л.

56

СЛОВАРЬ ОПРЕДЕЛЕНИЙ И ТЕРМИНОВ

Автогамия – копуляция ядер в пары внутри одной женской клетки без слияния клеток.

Автотрофия – способ питания организмов, самостоятельно синтезирующих из неорганических веществ, необходимые для жизни сложные органические соединения (белки, жиры, углеводы, витамины и др.).

Агамный – бесполый.

Агар – продукт, получаемый из красных водорослей, растворяется в воде при температуре 80…86 оС, используется в качестве ингредиента при приготовлении полужидких и плотных питательных сред в микробиологической и фитопатологической практике.

Адаптация – процесс приспособления организмов к конкретным условиям окружающей среды, необходимый для сохранения данного биологического вида.

Адвентивные почки – почки на растениях, возникшие из клеток и тканей, обычно их не образующих.

Акропетальный транспорт – транспорт веществ в растении по направлению к апикальным меристемам стебля.

Амплификация – образование дополнительных копий хромосомных последовательностей ДНК.

Андрогенез – процесс возникновения растения из микроспоры или пыльцевого зерна через соматический эмбриогенез либо через образование каллуса.

Антагонизм – противоположное действие, взаимное противодействие микроорганизмов. Взаимоотношения микроорганизмов в природе, когда при совместном развитии популяции одного вида угнетают развитие других.

Антеридии – мужские половые органы, в которых формируются половые клетки.

Антигены – белки, индуцирующие образование в иммунной системе антител, способных к специфическому взаимодействию с веществом, вызывающим образование антител.

57

Антистрессовые препараты – препараты, повышающие устойчивость растения в стрессовых условиях. Как правило, их действие связано с активацией синтеза организмом стрессовых белков.

Апикальный – верхушечный (рост).

Артефакт – явление, возникающее иногда при микроскопическом и других исследованиях, когда вследствие обработки объекта отмечают искажение результата.

Ассоциация микроорганизмов – сообщество различных видов микроорганизмов, существующее в естественно или искусственно созданных условиях.

Аттрагирующая способность – способность активировать транспорт питательных веществ к органу с наибольшей концентрацией фитогормоновстимуляторов (ауксины, гиббереллины, цитокинины, брассиностероиды).

Ауксины – фитогормоны (ИУК, НУК, 2,4-Д), активизирующие рост стеблей и корней, стимулирующие образование корней у проростков.

Аутосомы – набор хромосом, не включающий половые хромосомы (обозначаются цифрами: 1, 2, 3 и т. д.).

Базипетальный транспорт – транспорт веществ в растении по направлению к апикальным меристемам корня.

Бактерии – большая группа одноклеточных микроорганизмов, составляющих царство прокариот (Procaryotae). Для бактерий характерно отсутствие истинного ядра. Геном представлен двухцепочной молекулой ДНК и плазмидами.

Бактерии патогенные – возбудители инфекционных болезней. Бактериофаги (фаги) – вирусы, инфицирующие бактерии.

Библиотека генома – набор клонированных фрагментов ДНК, содержащий весь геном.

Биобезапасность – состояние защищенности человека, общества, цивилизации и окружающей среды от вредного, опасного для жизни и здоровья человека воздействия токсических и аллергенных биологических веществ и соединений, содержащихся в природных или генно-инженерно-модифицированных биологических объектах и полученных из них продуктах.

58

Биотроф – паразит, который получает необходимое питание и энергию из живых клеток другого организма – растений, животных, грибов, бактерий и др.

Биоремедиация – комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферы с использованием метаболического потенциала.

Биотехнология классическая – наука о методах и технологиях производства, хранения и переработки сельскохозяйственной и другой продукции с использованием обычных, нетрансгенных, растений, животных и микроорганизмов в природных (естественных) и искусственных условиях.

Биотехнология новейшая – наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных (модифицированных) растений, животных, микроорганизмов и вирусов в целях интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения.

Биоценоз – совокупность растений, животных и микроорганизмов, населяющих данный участок суши или водоема и характеризующихся определенными отношениями между собой и приспособленностью к условиям окружающей среды.

Биоэтика – область междисциплинарных исследований этических, философских и антропологических проблем, возникающих в связи с прогрессом биомедицинской науки и внедрением новейших технологий в практику здравоохранения.

Бластоспоры – споры, которые образуются путем почкования, то есть путем образования небольшого верхушечного, реже бокового бугорка, который растет и, достигая размера материнской клетки, отпадает.

Боксы микробиологические – изолированные, застекленные камеры, предназначенные для микробиологических, фитопатологических, биотехнологических исследований в асептических условиях.

Вектор – самореплицирующаяся (автономная) молекула ДНК, используемая в генетической инженерии для переноса генов и других последовательностей от организма-донора в организм-реципиент, а также для клонирования нуклеотидных последовательностей.

59

Вирулентность – индивидуальные особенности каждого штамма патогенного микроорганизма преодолевать естественные защитные барьеры макроорганизма определенного вида (породы, сорта), проникать в него, размножаться, образовывать токсины и др. и вызывать болезнь. Утрату вирулентности называют авирулентностью.

Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты растений, животных, насекомых, грибов, простейших, бактерий, микоплазм и других живых существ, неклеточные формы жизни, содержащие только один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).

Гаметангий – половой орган, в котором развиваются гаметы. Гаметофит – фаза полового цикла, начиная с прорастания спор до образо-

вания гамет, гаплоидная.

Гаметы – половые клетки, сливающиеся при оплодотворении. Гаплоид – организм, клетки которого содержат один набор хромосом.

Ген – единичная структура генетической информации, участок хромосомы (молекулы ДНК), кодирующий структуру одной или нескольких полипептидных цепей, или молекул РНК, или определенную регуляторную функцию.

Генетическая инженерия – совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения реком-бинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с ними и введению их в другие организмы.

Генетический код (ГК) – система записи наследственной информации в виде последовательности нуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот. Единицей ГК служит кодон, или триплет (тринуклеотид). ГК определяет порядок включения аминокислот в синтезирующуюся полипептидную цепь.

Генетический риск – возможность проявления непредсказуемых, опасных для здоровья и жизни человека и для окружающей среды наследственных изменений генома и качества организма.

Геном – совокупность генов, содержащихся в гаплоидном (одинарном) наборе хромосом данного организма. Диплоидные организмы содержат два генома – отцовский и материнский.

60