Биотехнология. Учебно-методическое пособие для проведения лабораторных занятий

Лабораторная работа 13 КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ КАРТОФЕЛЯ ПУТЕМ ЧЕРЕНКОВАНИЯ ПОБЕГОВ

Микроклональное размножение пробирочных растений осуществляют с помощью черенкования. Такое размножение основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушных почек на питательных средах образуются побеги.

Растения, сформировавшие пять-шесть листочков, в стерильных условиях извлекают из пробирок и делят на сегменты (отрезок стебля с листом и пазушной почкой). Черенки высаживают на глубину междоузлия в питательные среды либо без гормонов, либо с добавлением ауксинов. Черенки культивируют в тех же условиях, что и меристемы. Рост стебля и корней начинается на тре- тий-четвертый день после посадки на питательную среду, а полностью растения формируются через 12–15 дней. Каждое последующее черенкование проводят через 24–28 дней. Из одного растения можно получить пять – восемь черенков, а через 2–3 месяца – до 5 тыс. черенков.

Если почки или черенки высадить на питательные среды с высоким содержанием цитокининов, то образуется конгломерат почек и побегов. Полученные побеги легко отделяются друг от друга, их можно либо укоренить, либо использовать для дальнейшего микрочеренкования.

Цель работы: провести микроразмножение картофеля путем черенкования побегов.

Оборудование и материалы

Микробиологический бокс; пробирки с проростками; пробирки с питательной средой МС; стерильные препаровальные иглы, скальпели; флакон

с96 %-м спиртом; спиртовка; стерильные проростки картофеля в пробирках.

Ход работы

Подготовить микробиологический бокс и инструменты к работе. В асептических условиях извлечь стерильные проростки картофеля из пробирок. Побеги

41

разрезать на сегменты стебля с листом и пазушной почкой. Часть стебля над листом должна быть в два-три раза меньше, чем часть ниже листа. Микрочеренки помещают в питательную среду на глубину междоузлия. Пробирку закрыть пробкой, поместить в штатив и перенести в хорошо освещенную культуральную комнату. Необходимо соблюдать стерильность. Пробирки с черенками зарисовать. Через одну, две и три недели провести наблюдение за развитием побега и зарисовывать этапы развития растения из черенка.

42

Лабораторная работа 14 ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОКЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

in vitro

Впрактике биотехнологии на искусственных питательных средах с определенным набором биологически активных веществ можно укоренить побеги,

атакже индуцировать образование микроклубней. Для этого обычно используют среды с высоким содержанием минеральных солей (МС), углеводов (сахарозы – до 8 % от объема среды), цитокининов, абсцизовой кислоты, хлорхолинхлорида.

Втечение первых 10–12 суток после черенкования растения выращивают на обычном фотопериоде (16–17 часовом световом дне) с интенсивностью освещения 3–5 Клк, при температуре 25 °С днем и 19–20 °С ночью. Последующее культивирование проводят на 12 часовом фотопериоде при тех же степени освещенности и температуре.

Внекоторых случаях после выращивания в условиях длинного дня пробирки переносят в холодильник с температурой 10 °С. Образование микроклубней происходит через месяц-полтора.

Микроклубни хранят в холодильнике при температуре +5 °С и влажности воздуха до 95 %. Их закладывают в стерильные пробирки без среды по 10 микроклубней в каждую и закрывают пробками (срок хранения – до шести месяцев). Таким образом создаются условия, соответствующие периоду покоя картофеля, что способствует лучшей всхожести и жизнеспособности растений. Весь период от микрочеренкования до получения микроклубней составляет 60–65 суток.

Цель работы: изучить процесс клубнеобразования у проростков картофеля.

Оборудование и материалы

Микробиологический бокс, стерильные чашки Петри, пробирки с питательной средой для получения микроклубней, препаровальные иглы, пинцеты, скальпели, флаконы с 96 %-м спиртом для стерилизации инструментов, спиртовка, вата, стерильные проростки картофеля с пятью-шестью сформированными листьями в пробирках.

43

Ход работы

Встерильных условиях стерильными инструментами извлечь проростки

схорошо сформированными корнями из пробирок и перенести на питательные среды для индукции клубнеобразования. Пробирки с пересаженными в них растениями закрыть и перенести в культуральную комнату. В ходе опыта соблюдать световой и температурный режим. Провести наблюдение процесса клубнеобразования через четыре, шесть и восемь недель после начала культивирования. Результаты зарисовать, сделать выводы на основании теории гормональной регуляции. Заложить микроклубни на хранение.

44

Лабораторная работа 15 ОБНАРУЖЕНИЕ АМИЛАЗЫ В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ

Ферменты могут действовать не только в той клетке, которая их вырабатывает, но и вне ее, в том числе при выделении во внешнюю среду. Чтобы наблюдать быстрое выделение ферментов из клеток семян злаков, необходимо разрезать зерновки, так как семенная кожура и околоплодник препятствуют диффузии веществ.

Под действием фермента амилазы происходит гидролиз крахмала. В растениях встречаются две амилазы: α-амилаза, вызывающая распад крахмала на крупные молекулы (декстрины), и β-амилаза, которая отщепляет от крахмала концевые остатки мальтозы. В сухих семенах пшеницы, ржи, ячменя содержится только β-амилаза, причем почти вся она связана с белками. При прорастании β-амилаза переходит из связанного состояния в свободное, и, кроме того, происходит синтез α-амилазы.

Цель работы: изучить изменение активности амилаз в ходе прорастания семян.

Оборудование и материалы

Чашки Петри с крахмальным агаром, стакан с водой, раствор Люголя (1 г йодида калия, 1 г кристаллического йода в 100 мл дистиллированной воды), скальпель, пинцет, проросшие и непроросшие семена пшеницы.

Ход работы

Приготовить крахмальный агар. Для этого: взвесить 2 г агара, поместить в колбу, прилить 100 мл воды и осторожно кипятить до полного растворения агара; 2 г крахмала размешать стеклянной палочкой с 10 мл холодной воды, вылить в кипящий раствор агара и вновь довести до кипения. Горячую смесь разлить в чашки Петри и дать застыть.

Разрезать несколько непроросших зерен пшеницы пополам, слегка смочить водой и разложить пинцетом на одной половине чашки Петри с крахмаль-

45

ным агаром поверхностью среза вниз, не вдавливая семена в агар. На другую половинку чашки Петри поместить несколько проросших семян того же растения, также разрезанных пополам и смоченных водой (желательно оставить на некоторых проросших семенах корешки), и приложить их к поверхности крахмального агара. Закрыть чашки Петри, чтобы не было подсыхания семян. Через час осторожно снять семена и облить всю поверхность крахмального агара слабым раствором Люголя. Отметить, что в тех местах, где были размещены проросшие семена, агар не прокрасился, т. е. остался бесцветным. Результаты опыта зарисовать. Сделать вывод об изменении активности амилаз при прорастании различных семян.

46

Лабораторная работа 16 КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ КРАХМАЛА

Крахмал представляет собой полисахарид. Его молекула состоит из большого количества остатков глюкоз, соединенных попарно в мальтозы. Крахмал нерастворим в холодной воде, а в горячей образует коллоидный раствор – крахмальный клейстер. При кипячении крахмального клейстера с минеральной кислотой крахмал гидролизуется до глюкозы через ряд промежуточных продуктов с постепенно уменьшающейся молекулярной массой, называемых декстринами. Проследить за процессом гидролиза крахмала можно с помощью реакции с раствором йода, который окрашивает крахмал в синий цвет, амилодекстран – в фиолетовый, эритродекстран – в оранжевый, а с мальтодекстрином и мальтозой окрашивания уже не дает (остается желтым).

Цель работы: провести кислотный гидролиз крахмала и определить составляющие его компоненты.

Оборудование и материалы

Крахмал, 20 %-й НС1, раствор Люголя, Na2CO3, Феллингова жидкость, электроплитка, колбы, мерный цилиндр, стакан химический, штатив с пробирками, пипетки.

Ход работы

Приготовить 0,1 %-й крахмальный клейстер. Для этого отвесить 100 мг крахмала, высыпать крахмал в стаканчик, добавить 10 мл воды и тщательно размешать стеклянной палочкой. Налить в колбу 90 мл воды, нагреть до кипения, вылить в нее содержимое стаканчика, взболтать, дать раствору еще раз закипеть и снять с огня.

Поставить в штатив шесть-семь пробирок. Отлить в первую пробирку 3 мл крахмального клейстера. Добавить в колбу с крахмальным клейстером 5 мл 20 %-го НСl и нагревать на электроплитке. При появлении первых пузырьков (начало кипения) отлить из колбы 3 мл во вторую пробирку. Продолжать кипятить содержимое колбы, отливая из нее через каждые 5 мин по 3 мл в следую-

47

щие пробирки. Дать пробам в пробирках остыть, разбавить их водой и добавить по пять капель раствора Люголя. Если окрашивание проб йодом отсутствует, гидролиз можно считать оконченным. Проделать с раствором, оставшимся

вколбе, реакцию на редуцирующие сахара: налить 2–3 мл жидкости в чистую пробирку, нейтрализовать кислоту содой, прилить равный объем Феллинговой жидкости и довести до кипения. Результаты опыта записать в таблицу и зарисовать. Сделать вывод о причинах изменения окраски растворов, указать время,

втечение которого произошел полный гидролиз крахмала.

48

Приложение 1

РЕАКТИВЫ И КРАСИТЕЛИ

1.Феноловый анилиновый синий для прямого подсчета микроорганизмов: 15 мл 5 %-го (водного) раствора фенола смешивают с 1 мл анилинового синего и 4 мл ледяной уксусной кислоты; перед применением необходимо отфильтровать.

2.Карболовый эритрозин для прямого подсчета микроорганизмов: 5 г фенола и 1 г эритрозина растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

3.Карболовый генциановый фиолетовый для прямого подсчета микроорганизмов: 1 г генцианового фиолетового растворяют в 10 мл 96 %-го этанола, добавляют 100 мл 5 %-го фенолового раствора, полученную смесь отстаивают.

4.Насыщенный спиртовой раствор основного фуксина: 10 г красителя растворяют в 100 мл 96 %-го этанола.

5.Фиксирующий раствор Карноя: смесь 60 мл 100 %-го этанола с 30 мл хлороформа и 10 мл ледяной уксусной кислоты.

6.Раствор кристаллического фиолетового: 2 г кристаллического фиолетового растворяют в 20 мл 96 %-го этанола и смешивают с раствором 0,8 г оксалата аммония в дистиллированной воде; перед использованием отстаивают 24 часа.

7.Ацетоформол для фиксации микоризы: 50 %-й этанол –100 мл; ледяная уксусная кислота – 7 мл; 40 %-й формалин – 7 мл.

8.Фиксирующий раствор Джуэля для фиксации среза микоризы: 2 %-я хромовая кислота – 25 мл; 10 %-й хлорид платины – 2,5 мл; ледяная уксусная кислота 1 мл; дистиллированная вода – 75 мл.

9.Раствор йодистого калия с йодом: 20 г йодистого калия растворяют

в50 мл дистиллированной воды, добавляют 7 г кристаллического йода и дистиллированной водой доводят объем раствора до 300 мл.

10.Хромово-уксуснокислый раствор для фиксации микоризы: хромовый ангидрид – 7 г; ледяная уксусная кислота – 3 г; дистиллированная вода –

100 мл.

49

11.Хромовая смесь для мытья стеклянной посуды: в 100 мл концентрированной серной кислоты растворяют 50 г бихромата калия и полученный раствор вливают в 1000 мл дистиллированной воды.

12.Раствор метиленового синего Леффлера: к 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего, полученного растворением 3 г красителя, добавляют 100 мл дистиллированной воды и 1 мл 1 %-го раствора КОН.

13.Протрава для окрашивания жгутиков по Леффлеру: смесь 1 мл насы-

щенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 20 %-й дубильной кислоты и 5,5 мл насыщенного на холоде водного раствора NH4Fe(SO4)2 отстаивают в течение 2–3 суток; для повышения эффективности протравы к смеси можно добавить 0,2 мл 1 н. раствора NaOH.

14.Раствор Люголя: в 50 мл дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия, затем 1 г кристаллического йода и, добавляя дистиллированную воду, доводят объем раствора до 100 мл. Раствор встряхивают и отстаивают 24 часа. При необходимости для ускорения растворения йода добавляют несколько кристаллов йодистого калия. Хранят в склянке из темного стекла.

15.Водный раствор малахитовой зелени: 10 г краски растворяют в 20 мл воды; 5 мл насыщенного водного раствора добавляют к 100 мл дистиллированной воды.

16. Насыщенный раствор метиленового синего: 3 г краски растворяют в 100 мл 96 %-го этилового спирта. Раствор отстаивают в течение 2…3 суток, затем взбалтывают и фильтруют. Приготовленный раствор можно хранить длительное время.

17. Растворы Морозова для окрашивания жгутиков: I раствор: 1 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл формалина в 100 мл дистиллированной воды; II раствор: 5 г уксусной кислоты и 1 мл фенола в 100 мл дистиллированной воды; III раствор: 5 г кристаллического азотнокислого серебра в 100 мл дистиллированной воды. К 80 мл раствора азотнокислого серебра по каплям добавляют нашатырный спирт до растворения образующегося осадка, в результате получают опалесцирующий раствор. При внесении избыточного количества нашатырного спирта к раствору добавляют оставшиеся 20 мл азотнокислого серебра до получения опалесцирующего раствора. Для окрашивания жгутиков полу-

50