Биотехнология. Учебно-методическое пособие для проведения лабораторных занятий

Оптические приборы

Основными оптическими приборами для фитопатологических исследований являются световые микроскопы.

Начинают микроскопирование при малом увеличении (окуляр х7, 10, 15, объектив х8, 10, 20), затем переводят на большее увеличение, пользуясь объективом х40.

Микроскопия в светлом поле

Если микроскоп не имеет вмонтированного регулируемого источника света, то для полного использования его оптических возможностей необходимо установить освещение препарата в соответствии с принципом Келера.

Использование иммерсионного объектива

При изучении микроорганизмов часто пользуются масляноиммерсионным объективом (х90; Nap – 1,25 – 1,30), позволяющим достигать полезного увеличения в 630–1350 раз. Для получения такого увеличения необходимо капнуть каплю иммерсионного (кедрового) масла (n = 1,515) на препарат (покровное стекло или мазок), опустить в каплю линзу объектива и, медленно поднимать его макровинтом, наблюдая в окуляр появление изображения объекта. Точную фокусировку осуществляют микровинтом, вращая не более чем на пол-оборота. Показатель преломления кедрового масла близок к показателю преломления стекла. Благодаря этому лучи не рассеиваются, обеспечивая наилучшую видимость объекта. После работы необходимо мягкой тканью, смоченной этиловым спиртом, удалить с линзы объектива остатки иммерсионного масла.

Микроскопия в темном поле

Метод темного поля основан на эффекте, который можно наблюдать при прохождении луча света через темное помещение. В луче света становятся отчетливо видимы частички пыли, совершенно незаметные при естественном освещении. При наблюдении методом темного поля объект освещен сбоку проходящими по краям специального конденсора косыми лучами. Отраженные от препарата лучи частично попадают в объектив, и он становится видимым. На темном фоне вырисовываются светящиеся объекты. Метод темного поля поз-

11

воляет наблюдать только форму исследуемых микроорганизмов. Для изучения внутренних структур клетки он менее пригоден.

Фазовоконтрастная микроскопия

Этот метод позволяет получать на светлом фоне контрастное изображение живых неокрашенных объектов. Почти все биологические объекты под микроскопом прозрачны и поэтому не вызывают значительных изменений амплитуды световых волн при прохождении через них. Амплитуда остается неизменной, но происходит сдвиг фаз волновыхколебаний, которые человеческий глаз не улавливает. Эти изменения становятся видимыми при интерференции световых волн, когда разница фаз преобразуется в изменения амплитуды. Метод основан на том, что при помощи фазовоконтрастного устройства, состоящего из фазового конденсора и объективов с фазовыми пластинками в форме кольца, удается сдвинуть фазу волновых колебаний на 1800 и осуществить превращение фазовых колебаний проходящего через препарат света в видимые глазом амплитудные изменения.

Люминесцентная микроскопия

Основана на том, что объект, освещаемый коротковолновым светом (синим или фиолетовым, длиной волны 360–450 нм) начинает светиться. Первичная люминесценция наблюдается, если объект сам содержит химические вещества, способные флюоресцировать (светиться). Вторичная люминесценция – явление, при котором происходит свечение объекта после обработки его специальными красителями флюорохромами (акридином оранжевым, акридином желтым, конго красным, примулином, аурином и др. в концентрации 0,0001– 0,00001 %). Акридиновый оранжевый в разбавлении 1:5000 окрашивает протоплазму живых клеток в темно-зеленый, ядро в светло-зеленый, зерна хроматина в красный, а вакуоли в розовый цвет. Протоплазма погибших клеток приобретает красный цвет. Для люминесцентной микроскопии можно использовать обычный микроскоп с набором светофильтров и источником ультрафиолетового света.

Определение видовой принадлежности микроорганизмов связано с необходимостью их микроскопического измерения. Для этой цели используют окуляр- и объект-микрометры.

12

Окуляр-микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, в центре которой нанесена шкала с делениями по 0,1 мм.

Объект-микрометр – это стеклянная пластинка, в центре которой 1 мм ее длины разделен на 100 равных частей, т. е. одно деление объект-микрометра равно 0,01 мм, или 10 мкм.

Для определения цены одного деления окуляр-микрометра необходимо рассчитать, какое количество делений расположено в определенном количестве делений объект-микрометра. Для сравнения микрометров отвинчивают верхнюю линзу окуляра, помещают на округлую диафрагму окуляр-микрометр (шкалой вверх) и осторожно завинчивают линзу. Объект-микрометр помещают на столик микроскопа, на нем фокусируют оптическую систему и, когда видны обе линейки (объект- и окуляр-микрометров), устанавливают их так, чтобы левые крайние линии обоих микрометров совпадали. Если при этом, например, четыре деления объект-микрометра совпали с 20 делениями окуляр-микро- метра, то, зная, что каждое деление объект-микрометра равно 10 мкм, а четыре его деления – 40 мкм, определяют, что одно деление окуляр-микрометра равно 2 мкм. Определив цену деления окуляр-микрометра, объект-микрометр заменяют исследуемым препаратом, и производят его измерение. Для микроскопического изучения фитопатологических объектов из них готовят живые и фиксированные препараты. Для четкости обнаружения живых клеток и структур микроорганизмов производят витальную (прижизненную) окраску низкими концентрациями (не выше 0,5-1 %) красителей. Для приготовления фиксированных препаратов используют составы, содержащие летальные для микроорганизмов концентрации реактивов и красители, способные предельно четко окрашивать различные структуры биологических объектов (приложение 1).

13

Лабораторная работа 2 МОЛОЧНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ

Молочнокислое брожение представляет собой анаэробный процесс разложения углеводов ферментами молочнокислых бактерий с образованием молочной кислоты и других соединений. В зависимости от вида бактерий производящих этот процесс, конечные продукты брожения могут быть разными.

Цель работы: изучить процесс молочнокислоги брожения.

Различают гомоферментативное молочнокислое брожение, при котором молочный сахар образует только молочную кислоту:

C6H12O2 = 2CH3CHOHCOOH + 75,6 кДж

При гетероферментативном брожении, кроме молочной кислоты, образуются другие продукты (летучие кислоты, спирты, эфиры).

C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + CH3COOH + CH3CH2OH + CO2↑

Располагаются кокки в культуре попарно (диплококки) или короткими цепочками (стрептококки), реже одиночными клетками. У бактерии Streptococcus cremoris клетки расположены более длинными цепочками. Lactobacterium bulgaricum (болгарская палочка) – крупная бактерия (длиной 4–5 мкм), неподвижная, грамположительная, располагаются в виде отдельных клеток и коротких цепочек (стрептобактерия). Оптимальная температура ее развития +40…45 °С. Lactobacterium cucumeris (огуречная палочка) – короткая, неподвижная грамположительная бактерия. Клетки располагаются парами или цепочкой. Оптимальная температура развития бактерии +20…25 °С. Встречается в огуречном и капустном рассолах.

Микроорганизмы гетероферментативного брожения чаще встречаются в заквашенных овощах и силосе. К ним относятся Lactobacterium brassicae fermentatae (капустная палочка), Betabacterium breve, Leuconostoс mesentеroides

14

и др. Молочнокислые бактерии очень широко распространены в природе. Они всегда имеются в почве, на поверхности растений, и это является источником их постоянного появления в молочных и других продуктах. В промышленности используют культурные расы бактерий, которые имеют ряд преимуществ перед дикими формами.

Материалы и оборудование

Молочнокислые продукты, огуречный и капустный рассолы, микробиологические петли, спиртовки, раствор метиленового синего, пробирки, пинцеты, смесь Никифорова. Воронки со складчатыми фильтрами, 10 % раствор серной кислоты, 2 % раствор перманганата калия, 0,5 % раствор азотнокислого серебра, полоски фильтровальной бумаги, концентрированная серная кислота, насыщенный раствор медного купороса, 0,2 % спиртовой раствор тиофена, водяная баня.

Ход работы

Для ознакомления с бактериями молочнокислого брожения можно воспользоваться готовыми молочнокислыми продуктами и рассолом квашеной капусты и огурцов. Указанные продукты наносят петлей на предметное стекло, смешивают с каплей воды и делают тонкий мазок. Мазок фиксируют и одновременно обезжиривают смесью Никифорова (10 мин.). Окраску производят

втечение 3–5 минут водным раствором метиленового синего, промывают водой, высушивают и микроскопируют под иммерсионным объективом (х90).

Для доказательства образования молочной кислоты проводят качественную реакцию. К 10 мл фильтрата кисломолочных продуктов добавляют 1 мл 10 % раствора серной кислоты, нагревают до кипения и каплями добавляют 2 % раствор перманганата калия. При этом молочная кислота превращается

вуксусный альдегид, который можно обнаружить по потемнению фильтровальной бумаги, пропитанной 0,5 % раствором азотнокислого серебра. Другая качественная реакция заключается в добавлении к 2 мл фильтрата 5 мл концентрированной серной кислоты и 10 капель насыщенного раствора медного купороса. Смесь нагревают на водяной бане при +1000С в течение 5 минут. После охлаждения добавляют 3–5 капель 0,2 % раствора тиофена в спирту, который окрашивает раствор, содержащий молочную кислоту, в вишневый цвет.

15

Лабораторная работа 3 МАСЛЯНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ

Маслянокислое брожение – сложный процесс превращения углеводов в масляную кислоту, совершаемый группой анаэробных спорообразующих бактерий, относящихся к роду Clostridium семейства Bacillaceae.

Цель работы: изучить процесс маслянокислого брожения. Схематично процесс может быть изображен в виде следующего уровня:

С6H12O6 → CH3–CH2–CH2–COOH + 2CO2 + 2H2 + 495 кДж Маслянокислые бактерии имеют различные активные ферменты, способ-

ные производят расщепление сложных углеводов и образовывать масляную кислоту (бутират). Клостридии грамположительны. Благодаря перитрихиально расположенным жгутикам они очень подвижны. Вегетативные клетки палочковидные, однако, форма их может изменяться в зависимости от условий окружающей среды. Шарообразные эндоспоры изменяют форму палочковидной материнской клетки. Споры терморезистентны. Клостридии отличаются бродильным типом метаболизма и растут только в анаэробных условиях. Температурный режим роста большинства известных видов Clostridium лежит между +30…40 °С, хотя встречаются и термофильные виды с температурным оптимумом +60…70 °С. Клостридии способны расти только на нейтральной (или щелочной) реакции среды.

Материалы и оборудование

Большие пробирки, резиновые пробки к ним, клубни картофеля, пинцеты, скальпели, мел в порошке, водяная баня, раствор Люголя, 5 % раствор хлорного железа.

Неочищенный картофель нарезают ломтиками, которые помещают в пробирку и заполняют ее на 1/3 объема, добавляют щепотку мела и доливают водой почти до верха. Пробирки помещают в водяную баню при температуре +80 °С на 10-15минут. Затем пробирки закрывают пробками и ставят в термостат с температурой +35 °С. В этих условиях уже через 2–3 дня в жидкой фрак-

16

ции обнаруживают бактерии маслянокислого брожения из рода Clostridium, главным образом С. pasteurianum – подвижные палочки с закругленными концами, одиночные и парные.

Культура маслянокислых бактерий при этом является элективной. Для их преимущественного развития созданы анаэробные условия, бесспоровые формы убиты предварительным нагреванием, добавка мела нейтрализует образующиеся кислоты и способствует развитию бактерий.

При микроскопировании рекомендуется добавлять к капле культуральной жидкости капли Люголя. Микроскопируют раздавленную каплю с сухим объективном или с масляной иммерсией. Маслянокислые бактерии содержат в своих клетках гранулезу, которая окрашивается раствором Люголя в синий цвет.

С культуральной жидкостью проводят качественную реакцию на масляную кислоту. Для этого к 5 мл жидкости добавляют 2 мл 5 % раствора хлорного железа. При нагревании образуется маслянокислое железо коричневого цвета.

17

Лабораторная работа 4 СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ

Возбудители спиртового брожения широко распространены в природе (дикие дрожжи). Такими являются дрожжевые грибы рода Torula и Mycoderma, плесневые грибы рода Мисоr и некоторые бактерии. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces ellipsoideus выведены путем длительной селекции из диких дрожжей. Эти способны выдерживать большие концентрации спирта в среде, образуют меньше побочных продуктов брожения. Вследствие этого процесс брожения с их участием идет более интенсивно и дает лучшие конечные результаты.

Цель работы: изучить процесс спиртового брожения.

Суммарно процесс спиртового брожения выражается следующим уравнением: С6Н12О6 → 2С2Н5ОН+2СО2+130 кдж (31 ккал)

Материалы и оборудование

Колбы на 250 мл, сахарный песок, пекарские дрожжи, мерные цилиндры, пробки и изогнутые стеклянные трубки, водяные бани, электрические плитки, баритовая вода, пробирки, кристаллизаторы с водой, кристаллический иод, 10 %-й раствop NaOH, спиртовка, кристаллический К2Сr2О7, концентрированная серная кислота, пробки с прямыми стеклянными трубками.

Ход работы

В колбу емкостью 250 мл наливают 50 мл 10 %-го раствора сахара и около 1 г пекарских дрожжей, разведенных в 10 мл раствора сахара (10 %). Дрожжи следует развести за час до занятий и поставить в теплое место, чтобы повысить их активность. Колбу закрывают пробкой с изогнутой стеклянной трубкой. Нижний конец трубки погружают в пробирку с баритом. Колбу с бродящей жидкостью помещают в водяную баню, в которой периодическим подогреванием поддерживают температуру около 35…40 °С. Через несколько минут после установки прибора в пробирку с баритом начинают поступать пузырьки газа. Вначале они выделяются неравномерно, толчками, так как из колбы выходит нагретый воздух. Через некоторое время (20…30 мин) пузырьки начинают выходить равномерной цепочкой.

18

Можно считать, что к этому времени весь воздух из колбы вытеснен и через трубку выходит один из продуктов брожения — углекислый газ. Баритовая вода интенсивно мутнеет вследствие образования углекислого газа. Доказать образование спирта на том же занятии не удается, так как его накапливается за это время недостаточно.

Колбы с бродящей жидкостью закрывают ватными пробками и оставляют до следующего занятия в комнате. На следующем занятии в жидкости обнаруживают спирт несколькими способами.

Реакция с кристаллическим иодом

К жидкости, взятой из колбы для пробы, добавляют немного 10%-ного раствора NaOH и пробирку с этой смесью подогревают на спиртовке, не доводя до кипения. Затем добавляют несколько кристаллов иода и снова нагревают. При этом образуется йодоформ, окрашивающий жидкость в желтый цвет и имеющий характерный запах.

СН3СН2ОН + I2 = СH3CНO + 2HI СH3CНO + 3I2 = СI3CНO + 3HI СI3CНO + NaOH = СHI3 + HCOONa

Реакция с двухромовокислым калием

К испытуемой жидкости добавляют кристаллик бихромата калия и несколько капель концентрированной серной кислоты, нагревают смесь на спиртовке. Цвет жидкости при этом изменится до зеленого вследствие восстановления хрома. Выделяющийся уксусный альдегид ощутим по запаху. Ход реакции:

К2Сr2O7 + 4H2SO4 + 3С2Н5ОН → K2Cr2 (SO4)4 +ЗСН3СОН + 7Н2О

Обнаружение спирта отгонкой

Колбу с бродильной жидкостью закрывают пробкой, в которую вставлена идущая вверх прямая стеклянная трубка длиной 40–50 см. Колбу нагревают до равномерного кипения жидкости и к концу стеклянной трубки подносят горящую лучинку. Выделяющиеся пары спирта воспламеняются, над трубкой возникает эффектный факел, наблюдаемый в течение нескольких секунд. Кипение не должно быть слишком бурным, иначе жидкость будет выплескиваться через трубку.

19

Лабораторная работа 5 БРОЖЕНИЕ ПЕКТИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ

Пектиновые (межклетные) вещества (греч. pectys — студень) нерастворимы в воде, но способны к набуханию. Они в значительном количестве содержатся в любом растительном материале. В технических культурах (лен, конопля, кендырь и др.) лубяные волокна соединены с кострой и паренхимой при помощи пектиновых веществ. Поэтому пектиновое брожение нашло широкое применение при технической обработке волокнистых растений.

Цель работы: изучить процесс брожения пектиновых веществ.

Пектин разрушается микроорганизмами, содержащими фермент пектиназу. Химизм брожения пектиновых веществ состоит из двух последовательно идущих стадий. В первой стадии осуществляется гидролиз пектиновых веществ до сахаров, во второй происходит дальнейшее сбраживание отдельных продуктов гидролиза (галактозы и арабинозы) до масляной кислоты, СО2 и Н20.

С46Н68О40 + 10Н2О → 4СНО(СНОН)4СООН + С5Н10О5 + С5Н10О5 + + С6Н12О6 + 2СН3ОН + 2СН3СООН

Возбудители маслянокислого брожения пектиновых веществ — облигатные анаэробы. Они подвижны, образуют споры; сбраживают пектин, глюкозу, арабинозу, крахмал, но не сбраживают клетчатку. По отношению к источникам азота малотребовательны. Наряду с пектином хорошо усваивают и минеральные формы азота.

Материалы и оборудование

Льняная солома; пробирки; ножницы; водяная баня; раствор Люголя (I+KI); 5 %-й раствор хлорного железа; пипетки; пинцеты, скальпели; предметные и покровные стекла; микроскопы.

Ход работы

Для изучения брожения пектиновых веществ можно поставить следующий опыт. Снопик льняной соломы высотой 6–7 см перевязывают в двух местах ниткой и вносят в пробирки, лучше большего размера, чем стандартные. Про-

20