Биотехнология. Учебно-методическое пособие для проведения лабораторных занятий

бирки наполняют на 2/3 водопроводной водой, зажимают пинцетом и кипятят на горелке 2–3 мин для удаления экстрактивных (легко сбраживаемых) веществ, которые могут служить источником углерода для других маслянокислых бактерий. Вода приобретает желто-зеленый цвет. Ее сливают. Наполнив пробирку вновь водопроводной водой, вторично кипятят несколько минут и снова сливают жидкость. Так поступают 5–6 раз. После последнего кипячения жидкость не сливают. Охлаждают пробирку под краном и в снопик вводят свежий стебель, не подвергавшийся нагреванию.

Пробирку со снопиком ставят в термостат при 30–35 °С. Через 2–3 дня

вней начинается брожение, а через 5–8 дней оно заканчивается. Накопление

вкультуральной жидкости масляной кислоты (наряду с уксусной кислотой, возникающей при гидролизе пектина) можно обнаружить с помощью качественных реакций. Микроскопироваиие возбудителей брожения пектиновых веществ. Извлекают снопик из пробирки, берут из середины его несколько соломинок и выжимают из них немного жидкости на предметное стекло. Добавляют каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют с иммерсионной системой.

На препарате обычно выявляются крупные палочковидные бактерии с плектридиальным типом спорообразования (барабанная палочка) и прерывистым расположением гранулезы, окрашенной в синий цвет. Это Clostridium pectinovorum. Нередко на препарате обнаруживается Clostridium felsineum —

палочки меньшего размера, сигарообразной формы со спорой на конце. Гранулеза может заполнять всю вегетативную часть клетки.

21

Лабораторная работа 6 БИОДЕСТРУКЦИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

Клетчатка составляет от 20 до 60 % сухой массы растений. Отмершие части растений попадают в почву и там подвергаются разрушению. Разрушение клетчатки ведут бактерии, грибы и актиномицеты. Трансформация клетчатковых масс идет в разных условиях аэрации, при неодинаковой температуре и при различной рН среды.

Цель работы: изучить процесс биодеструкции целлюлозы.

Процесс разрушения клетчатки начинается с ферментативного гидролиза. Под действием фермента целлюлазы клетчатка гидролизуется до целлобиозы, далее целлобиаза под влиянием фермента целлобиазы переходит в глюкозу. Схематично эти процессы могут быть выражены уравнением:

(С6Н10О5)n + Н2О → nС12Н22О11 + Н2О nС6Н12О6

Глюкоза в аэробных условиях окисляется микроорганизмами до углекислого газа и воды. Процесс сопровождается выделением большого количества энергии.

В анаэробных условиях глюкоза сбраживается по типу маслянокислого брожения. Состав конечных продуктов может быть различным в зависимости от вида микроорганизма, ведущего процесс разрушения клетчатки. В аэробных условиях наиболее активно разрушают клетчатку бактерии, входящие в поря-

док Myxobacteriales.

Род Cytophaga представлен длинными палочковидными клетками с заостренными концами, несколько изогнутыми (2–10 мкм). В старой культуре появляется много нитевидных и шаровидных инволюционных форм. Колонии желтого, оранжевого, коричнево-бурого цвета, гладкие, слизистые. Эти бактерии широко распространены в почве.

Род Cellvibrio представлен мелкими, слегка изогнутыми палочками, подвижными (2–4 мкм). Колонии охряно-желтые, зеленые, слизистые. Встречаются в почве.

22

Род Cellfalcicula имеет вид коротких толстых палочек, серповидно изогнутых, с заостренными концами (2,0х0,7 мкм). Образует слизистые колонии зеленоватого, палевого цвета. Выделяется из почвы.

Род Sorangium в молодой культуре имеет вид сравнительно толстых, слегка изогнутых палочковидных клеток с закругленными концами (2–5 мкм). При старении культуры образуются плодовые тела, состоящие из микроцист. Палочковидные клетки укорачиваются, покрываются толстой оболочкой, приобретая неправильные очертания. Колонии ярко-оранжевого, фиолетового цвета. Легко выделяется из подзолистых луговых и окультуренных почв, а также m кроличьего и конского навоза.

Род Polyangium представлен почти прямыми палочковидными клетками с закругленными концами (3,5–8 мкм). При старении формируются овальные микроцисты, которые соединяются в плодовые тела грушевидной формы, желтого, оранжевого цвета.

Помимо бактерий в аэробном разрушении клетчапчи учаи вуют плесневые грибы Aspergillus, Penicillum, Fusarium, Cladosporium, Trichoderma и некоторые актиномицеты рода Streptomyces и рода Micromonospora.

В анаэробных условиях процесс разложения клетчатки идет за счет мезо-

фильных и термофильных бактерий рода Clostridium. Clostridium omelianskii

имеет вид длинных палочковидных клеток (4–8 мкм), в старых культурах длиной до 10–15 мкм, расположенных одиночно или соединенных в нити. Споры шаровидные, формируются на конце клетки, клетка принимает форму барабанной палочки. Выделяется из почвы и воды. Оптимальная температура роста 25–30 °С.

Из термофильных форм особо активно разрушает клетчатку Clostridium thermecellum. Он представлен прямыми или слегка изогнутыми палочками с округлой спорой на конце клетки. Оптимальная температура роста 55–60 °С.

Материалы и оборудование

Чашки Петри, колбы на 250 мл, фильтровальная бумага, ножницы, скальпель, спиртовка, пинцет, предметные стекла, микробиологическая петля, стеклянная палочка с оттянутым концом, часовое стекло, пробирка со стерильной

23

дистиллированной водой, колба с жидкой средой Гетчинсона, колба с агаризованной средой Гетчинсона, среда Имшенецкого, исследуемая почва навоз, водные растворы фуксина и генцианвиолета, микроскоп.

Ход работы

Выделение анаэробных целлюлозоразрушающих бактерий. Для получения накопительной культуры анаэробных целлюлозоразрушающих бактерий используют питательную среду Имшенецкого.

Питательную среду разливают высоким слоем в большие пробирки и в каждую пробирку нарезают 2–3 полоски фильтровальной бумаги длиной 6–8 см, шириной 0,5 см. Пробирки с питательной средой стерилизуют в автоклаве при давлении 1 атм в течение 20 мин. Пробирки заражают комочком почвы. Часть пробирок помещают в термостат при температуре 30–35 °С для выделения мезофильных форм, остальные пробирки выдерживают в термостате при 60–65 °С для наколления термофильных целлюлозоразрушающих бактерий.

При 60 °С через 3–4 суток в пробирках бурно начинается процесс разрушения клетчатки, жидкость пенится, выделяются газы. Полоски фильтровальной бумаги желтеют, ослизняются, постепенно превращаясь в аморфную массу,

иоседают на дно. Брожение заканчивается на 8–10-е сутки. При температуре 30– 35 °С разрушение клетчатки идет медленнее и заканчивается через 2–3 недели.

Разрушенные массы клетчатки подвергают микроскопическому анализу. Микробиологической петлей разрушенную клетчатку переносят на предметное стекло и делают мазок. Мазок окрашивают фуксином или генцианвиолетом

имикроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. В поле зрения микроскопа видны длинные палочки, спорулирующие клетки типичной плектридиальной формы и свободнолежащие споры.

Для выделения аэробных клетчаткоразрушающих бактерий используют питательную среду Гетчинсона. Питательную среду стерилизуют 20 мин в автоклаве при 1 атм. Параллельно из фильтровальной бумаги готовят складчатые фильтры и стерилизуют их в термостате или автоклаве. Питательную среду разливают в конические колбы слоем 1,5–2 см, среду заражают комочком поч-

24

вы и на поверхность среды опускают складчатый фильтр конусом вверх. Колбы закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 25– 30 °С на 10–14 суток. На границе питательной среды и воздуха создаются оптимальные условия питания и аэробного дыхания клетчаткоразрушающих бактерий. В этой зоне наиболее интенсивно идет процесс разрушения фильтровальной бумаги.

Через 8–10 суток на фильтре появляются желто-оранжевые пятна колоний клетчаткоразрушающих бактерий. Бумага фильтра ослизняется, разлагается, и фильтр постепенно оседает на дно. Из разрушенных масс клетчатки в колбе микробиологической петлей готовят мазок в капле жидкости. Мазок окрашивают фуксином или генцианвиолетом и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. На препарате среди волокон клетчатки видны различные клетчат- ко-разрушающие бактерии, обрывки мицелия грибов, споры грибов.

Относительное количество аэробных клетчаткоразрушающих бактерий в почве определяют методом посева комочков почвы на пластинки агаризованной среды Гетчинсона.

Среду Гетчинсона агаризуют, добавляя к ней 2 % агар-агара, и стерилизуют 20 мин в автоклаве при 1 атм. Из фильтровальной бумаги вырезают фильтры по размеру чашек Петри и тоже стерилизуют. Соблюдая стерильность, разогретую среду Гетчинсона разливают в чашки Петри и на поверхность среды накладывают клетчатковый фильтр. Микробиологической петлей высевают комочки почвы на поверхность фильтра, раскладывая их параллельными рядами на расстоянии 1 см. Засеянные чашки Петри помещают ставят его в термостат при температуре 25–30 °С.

Через 10–14 суток вокруг комочков почвы развиваются колонии клетчаткоразрушающих микроорганизмов в виде желтых, зеленых, оранжевых и коричневых пятен. В районах колоний бумага фильтра разлагается, ослизняется, становясь прозрачной. По характеру можно дифференцировать колонии плесневых грибов, актиномищетов и бактерий. Таким образом можно определить относительное количество клетчаткоразрушающих бактерий в почве.

25

Лабораторная работа 7 ИЗУЧЕНИЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

На земном шаре в год связывается 18010 т азота, из них 9010 т на сельскохозяйственных угодьях и 4010 т – в промышленности.

Симбиотическая азотфиксация – это способность бактерий связывать молекулярный азот, находясь в симбиозе с высшими растениями. В настоящее время насчитывается более 1300 видов бобовых и 200 видов не бобовых растений (ольха, восковник, лох, облепиха, мхи, злаки и др.), которые находятся в симбиотических взаимоотношениях с азотфиксирующими бактериями. Клубеньковые бактерии в симбиозе с растениями семейства бобовых ежегодно фиксируют 100–300 кг/га азота. Свободноживущие азотофиксирующие микроорганизмы вносят в почву 1–3 кг/га азота в год.

Цель работы: изучит развитие клубеньковых бактерий на растениях семейства бобовые.

Клубеньковые бактерии относятся к семейству Rhizobiaceaе, родам

Rhizobium (преимущественно), Bradyrhizobium, Azorhizobium и другим. Виды рода Rhizobium представляют собой аэробные палочки, характеризующиеся избирательностью (специализацией) по отношению к растению-хозяину. Это свойство легло в основу систематики клубеньковых бактерий. Выделяют следующие виды рода Rhizobium: Rh. leguminosarum – бактерии живущие на горохе, вике, кормовых бобах, чечевице; Rh. phaseoli – фасоли; Rh. japonicum – сои;

Rh.vigna – вигны, маша, арахиса; Rh. cicer – нута; Rh. lupini – люпина; Rh. trifollii – клеверов; Rh. meliloti – люцерны, донника, тригонеллы; Rh. simpiex – эспарцета; Rh. lotus – лядвенца; Rh. robinii – акации. Заражение происходит только через молодые корневые волоски. Иногда наблюдается и сортовая специфичность, особенно у соевых бобов, люпина, бобов. При перекрестном заражении растения слабо фиксируют атмосферный азот. Узнавание происходит посредством белков (лектинов – гликопротеинов) на клеточной стенке корнево-

26

го волоска и полисахаридов (липополисахаридов) клеточной оболочки бактерий. Свойство бактерий инфицировать корни растений называется – вирулентностью. Повышают вирулентность посредством пассирования культуры через растения. Активность (эффективность) – способность в симбиозе с растениями ассимилировать молекулярный азот. Клубеньки образуются активными расами

иокрашены в розовый цвет. Окраску предает пигмент леггемоглобин.

Утропического бобового растения Sesbania rostrata клубеньки образуются не только на корнях, но и на стебле и в условиях влажного жаркого климата фиксируют атмосферный азот.

Клубеньковые бактерии рода Rhizobium грамотрицательны. Представляют собой палочковидные клетки размером 0,5–0,9 х 1–3 мкм; размеры бактероид-

ных форм (Y-, V-, Т-образных, звездчатых или грушевидных) могут быть в 10 раз больше. Начало азотофиксации сопровождается появлением инволюционных форм и образованием леггемоглобина.

Инфецирование бактерий происходит только через корневые волоски. Бактерии внедряются на самом конце или около конца волоска и растут в форме инфекционной нити до его основания. Затем нити, одетые целлюлозной оболочкой, проникают сквозь тонкие стенки молодых клеток эпидермиса в кору корня. Натолкнувшись на тетраплоидную клетку коры, нить стимулирует как деление самой этой клетки, так и соседних диплоидных клеток. Инфекционные нити разветвляются и распределяются по тетраплоидным клеткам. Под действием ростовых веществ бактерий происходит разрастание ткани и образуются клубеньки. Бактерии в клубеньках размножаются быстро и образуют крупные клетки неправильной формы – бактероиды, объем которых в 10–12 раз превышает объем свободноживущих бактерий рода Rhizobium. Бактероиды располагаются по отдельности или группам, окруженные мембраной, в цитоплазме растительной клетки. Ткань, заполненная бактерия, имеет красноватую окраску – содержит пигмент леггемоглобин, родственный гемоглобину крови. Азот фиксирует только клубеньки, содержащие леггемоглобин. При разрушении леггемоглобина и образовании зеленых желчных пигментов (биливердинов) пре-

27

кращается связывание азота. Леггемоглобин, вероятно, находится в цитоплазме клеток, а не в бактероидах. Леггемоглобин представлен Fe (II) – содержащей формой, обладает высоким сродством к кислороду. Возможно, облегчает диффузию кислорода через клетку растения к бактероиду. Фиксация азота происходит только бактероидами и 95 % фиксированного азота переходит в виде ионов аммония в цитоплазму растения-хозяина.

Удревесной и кустарниковой растительности клубеньки образуются азотофиксирующими актиномицетами, а у травянистой – бактериями, образующими актиноризу. У не бобовых растений эндосимбионтами, способными фиксировать азот часто являются актиномицеты, относящиеся к роду Frankia. После проникновения в корневые волоски, стенки которых утолщаются и скручиваются, гифы покрываются толстым чехлом, который по мере продвижения утончается и гифы окружаются капсулой. Из корневого волоска гифы проникают в эпидермис и кору, вызывая деление и гипертрофию клетки. Заполняют центр клетки растений, а у клеточной стенки концы гиф расширяется и образует везикулы.

Утравянистых растений – злаковые, осоковые, лютиковые и т. д. обнару-

жены бактерии рода Klebsiella (Azotobacter, Enterobacter). Эпифитная, фил-

лосферная азотфиксирующая микрофлора.

Материалы и оборудование

Зафиксированные корневые системы бобовых растений, фиксированные клубеньки, ботаническая бритва, водный раствор фуксина, метиленовый синий, предметные покровные стекла, пинцет, препаровальные иглы, микроскоп, микробиологическая петля, чашки Петри, пробирки с бобовым агаром, бюксы, 0,1 %-й раствор сулемы, 96 %-й спирт, стерильная дистиллированная вода, шпатели Дригальского, пробирки с косяками бобового агара.

Ход работы

На фиксированном материале рассматривают клубеньки на корнях разных бобовых растений и делают зарисовки (горох, фасоль, клевер, люпин и др.).

28

Для изучения строения клубеньков острой ботанической бритвой готовят тонкий срез через клубенек. Срез помещают в каплю воды на предметное стекло, подкрашивают фуксином или метиленовым синим и микроскопируют при увеличении микроскопа (окуляр 10х, объектив 40х), На препарате хорошо видна бактероидная ткань клубенька, а в ней просматривается масса клубеньковых бактерий.

Для более точного изучения морфологии клубеньковых бактерий следует приготовить фиксированный, окрашенный мазок и микроскопировать его, пользуясь объективом МИ-90. Для приготовления мазка разрезают клубенек и отжимают каплю сока на предметное стекло. Если клубеньки маленькие, их разрушают препаровальными иглами и полученный материал распределяют по стеклу. Мазки фиксируют, окрашивают и просматривают.

29

Лабораторная работа 8 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ

Цель работы: изучить возможность использования клубеньковых бактерий для получения биопрепаратов.

Для выделения клубеньковых бактерий в чистую культуру делают посев истощающим мазком капли сока из клубенька на бобовый агар в чашки Петри. Соблюдая стерильность, разогретый бобовый агар или среду Фреда разливают в три стерильные чашки Петри и дают застыть. Клубеньки тщательно отмывают от почвы, погружают на 1 мин в 96 %-й этиловый спирт и промывают стерильной дистиллированной водой. После обработки наиболее крупный клубенек, соблюдая стерильность, переносят в чашку Петри в каплю воды и раздавливают его пинцетом. Микробиологической петлей каплю сока переносят на середину питательной среды, находящейся в чашке Петри, и шпателем делают посев истощающим мазком последовательно еще на две чашки. Засеянные чашки Петри помещают в термостат при температуре 25–28 °С.

По скорости роста различают быстрорастущие клубеньковые бактерии (клевера, гороха), колонии которых образуются на 4–5-й день роста, и медленнорастущие клубеньковые бактерии (люпина, сои), колонии их проявляются хорошо лишь на 9–10-е сутки после посева.

Колонии клубеньковых бактерий беловатые, слизистые, развиваются на поверхности среды и в толще бобового агара. Колонии бактерий микроскопируют при малом увеличении микроскопа и делают описание.

Для изучения морфологии клубеньковых бактерий из их колоний готовят мазки. Мазки фиксируют, окрашивают и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. На мазках отмечают фазу развития клубеньковых бактерий, делают зарисовки.

Для дальнейшей работы микроорганизмы из развившихся колоний отсевают в чистую культуру на косой агар в пробирки.

30