Биотехнология. Учебно-методическое пособие для проведения лабораторных занятий

Приготовление и определение качества биопрепаратов

Биопрепарат представляет собой культуру клубеньковых бактерий, внесенную в стерильный субстрат – почву, торф, каолин, его готовят для каждого вида бобового растения отдельно.

Материалы и оборудование

Пробирки с бобовым бульоном, бобовым агаром и МПА, чистая культура клубеньковых бактерий на косом бобовом агаpе, колбы по 0,5 л, торф, спиртовка, микробиологическая петля, колбы со стерильной дистиллированной водой, стерильные пипетки на 1 мл, стерильные чашки Петри, весы, разновесы, скальпель, стерильное часовое стекло.

Ход работы

Приготовление биопрепарата.

Торф насыпают в колбы, увлажняют до 30–40 % от полной влагоемкости и стерилизуют в автоклаве 2 ч при давлении 1,5 атм. Жесткая стерилизация необходима для гибели споровых форм бактерий.

Параллельно выращивают культуру клубеньковых бактерий. Для производства биопрепарата чистую культуру клубеньковых бактерий, выделенную из активных клубеньков, засевают в пробирки с бобовым бульоном и культивируют в термостате при 25–28 °С, медленнорастущие бактерии (люпина, сои, арахиса) – 10–12 суток, быстрорастущие формы бактерий (фасоли, клевера, гороха, чины) – 4–6 суток.

Культуру клубеньковых бактерий вносят в колбы со стерильным субстратом. Колбы помещают в термостат для размножения бактерий, как указано выше. На этикетке колбы указывают, для какого бобового растения приготовлен биопрепарат, дату изготовления препарата и номер штамма клубеньковых бактерий.

По стандарту в биопрепарате медленнорастущих клубеньковых бактерий (сои, люпина, арахиса) должено содержаться не менее 70 млн бактериальных клеток на 1 г, для быстрорастущих клубеньковых бактерий (гороха, фасоли, бобов и др.) не менее 300 млн кл./г. Годность препарата 9 месяцев.

31

Определение качества биопрепарата

Качество биопрепарата определяется титром клубеньковых бактерий и заражением препарата посторонней микрофлорой.

Определение количества клубеньковых бактерий в биопрепарате.

На часовом стекле, соблюдая стерильность, отвешивают 10 г биопрепарата и переносят в колбу № 1 с 90 мл стерильной дистиллированной воды, получают разведение 10–1. Содержимое колбы тщательно взбалтывают в течение 5 мин, затем, соблюдая стерильность, пипеткой переносят 1 мл суспензии в колбу № 2 с 99 мл стерильной дистиллированной воды, получают разведение 10–3. Содержимое колбы № 2 встряхивают в течение 2 мин и, соблюдая стерильность, 1 мл суспензии переносят в колбу № 3, получают разведение 10–5. Подобным образом готовят разведение 10–7 в колбе № 4. Разведение 10–9 получают

вколбе № 5 с 99 мл стерильной дистиллированной воды. Содержимое быстрорастущих клубеньковых бактерий определяют в разведениях 10–6 и 10–7, медленнорастущих в разведениях 10–5 и 10–6.

Соблюдая стерильность, из соответствующих разведений пипеткой переносят по 1 мл суспензии в 2–3 параллельные чашки Петри и заливают тонким слоем расплавленного и охлажденного до 40 °С бобового агара. Вращая чашку Петри, содержимое тщательно перемешивают. Засеянные чашки Петри помещают в термостат при температуре 28–30 °С. Быстрорастущие формы оставляют на 4–6 суток, медленнорастущие на 9–10 суток. Далее подсчитывают число колоний, развивщихся на агаровых пластинках в чашках Петри, и выводят среднее из 7 повторностей. Расхождение между числом колоний на параллельных чашках не должно превышать 30 %. Умножив среднее число колоний на соответствующие разведения, вычисляют количество клубеньковых бактерий

в1 г биопрепарата.

Определение содержания посторонних микроорганизмов в биопрепарате

Биопрепарат не должен содержать грибов и актиномицетов. Количество посторонних бактерий не должно превышать 3 % от общего числа быстрорастущих клубеньковыхбактерий и7 % от числамедленнорастущихклубеньковыхбактерий.

32

Определение количества посторонней микрофлоры ведут параллельно определению содержания клубеньковых бактерий. Соблюдая стерильность, пипеткой переносят по 1 мл суспензии из тех же разведений в две параллельные чашки Петри и заливают МПА. Засеянные чашки Петри помещают в термостат при температуре 28–30 °С на 2–3 суток. Затем подсчитывают среднее число колоний, развившихся на чашках при определенном разведении, и, умножив на соответствующее разведение, определяют содержание бактерий в 1 г биопрепарата.

Питательные среды

Среда Фреда: маннит (сахароза или глюкоза) – 10,0 г; КН2РО4 – 0,5 г; MgSO4 – 0,2 г; NaCl – 0,1 г; СаСО3 – 3,0 г; дрожжевая вода (рН 6,8) – 100 мл;

агар – 15 г; дистиллированная вода (рН 7,0) – 1 л.

Бобовый агар: бобовый отвар – 1000 мл; сахароза – 2 г; КН2РО4 – 1,0 г, MgSO4 – 0,3 г; агар – 15,0 г.

В бобовый агар добавляют NaHCO3 до рН 7,0 и стерилизуют при 121 °С в течение 30 мин.

Для приготовления бобового отвара 50 г бобов (белой фасоли или гороха) заливают 1 л водопроводной воды и варят до набухания и растрескивания кожуры (бобы не должны развариваться). Отвар фильтруют через вату (марлю) и доводят водопроводной водой до 1 л.

На этих средах клубеньковые бактерии образуют бесцветные или молочнобелые, часто слизистые, колонии, за исключением розово-красных колоний клубеньковых бактерий из клубеньков Lotononis bainesii.

На скошенном бобовом агаре быстрорастущие клубеньковые бактерии обильно развиваются, образуя прозрачные слизистые, часто стекающие вниз мощные колонии-штрихи. Медленнорастущие бактерии люпина и сои образуют менее прозрачные с небольшим количеством слизи и более плотные, похожие на капли стеарина, беловатые колонии-штрихи.

Клубеньковые бактерии хорошо растут также на среде Лазаревой:

КН2РО4 – 0,5 г; MgSO4 – 0,2 г; NaCl – 0,2 г; MnSO4 – 0,005 г; NH4MoO4 – 0,002 г;

33

маннит или сахароза – 10 г; дрожжевая вода – 100 мл, агар – 15 г; 1 л водопроводной воды.

Среда Норриса: К2НРО4 – 0,5 г; MgSO4-7H2O – 0,8 г; NaCl – 0,2 г; FeCl3 –

0,01 г; маннит – 10 г; свежеприготовленный дрожжевой экстракт – 100 мл; рН 7,2; 1 л водопроводной воды.

Для медленнорастущих клубеньковых бактерий (сои, люпина) используют среду Исварана: маннит или сахароза – 10 г; К2НРО4 – 0,5 г; MgSO4 – 0,2 г; NaCl – 0,1 г; глюконат кальция – 1,5 г; FeCl3 – 0,01 г; дрожжевой экстракт – 2 г; агар – 20 г; 1 л водопроводной воды.

Для проверки чистоты выделенной культуры делают посев на МПА, так как, кроме клубеньковых бактерий люцерны и донника, ни одна культура клубеньковых бактерий на МПА не развивается.

34

Лабораторная работа 9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ

Широкое использование антибиотиков в рационе животных, а также для профилактики и лечения болезней привело к появлению резистентных (устойчивых) форм микроорганизмов. Для определения чувствительности бактерий, используют метод бумажных дисков, пропитанных антибиотиками. Метод основан на диффузии антибиотика из пропитанного им диска фильтровальной бумаги в плотную питательную среду. Содержание большинства антибиотиков в дисках колеблется от 1 до 50 мкг.

Цель работы: определить чувствительность микроорганизмов к различным антибиотикам.

Оборудование и материалы

Чашки Петри с мясопептонным агаром; микробиологические петли; диски из фильтровальной бумаги, пропитанные различными растворами антибиотиков; стеклянный шпатель; пипетки; спиртовка, чистые культуры микроорганизмов.

Ход работы

На поверхность среды высевают суспензию суточной культуры микроорганизмов. Пипеткой берут 0,02 мл суспензии микроорганизмов (одна капля) и стерильным шпателем распеределяют на питательной среде в чашке Петри. Стерильным пинцетом раскладывают диски фильтровальной бумаги, предварительно пропитанные разными антибиотиками. Затем Чашки Петри помещают в термостат при 37 °С на 18–24 ч. При оценке результатов опыта измеряют диаметр задержки роста микроорганизмов вокруг дисков с антибиотиками, включая диаметр самих дисков. Отсутствие зоны задержки роста микроорганизма означает, что испытуемый штамм устойчив к данному препарату. Зоны диаметром до 10 мм указывают на малую чувствительность, а зоны диамером более 10 мм – чувствительность к антибиотику.

35

Лабораторная работа 10 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К ФИТОНЦИДАМ

Фитонциды являются веществами, создаваемыми растениями в процессе обмена веществ. Они способны ингибировать рост и развитие различных микроорганизмов. В качестве источников фитонцидов можно использовать чеснок, репчатый лук, хрен, редьку, лимон и др.

Цель работы: выяить чувствительность микроорганизмов к действию различных фитонцидов.

Оборудование и материалы

Чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА), микробиологические петли, чеснок, репчатый лук, хрен, редька, лимон, стеклянный шпатель, пипетки, спиртовка, чистые культуры микроорганизмов.

Ход работы

В стерильные, чашки Петри равливают по 10 мл МПА. На поверхность среды высевают суспензию суточной культуры микроорганизмов, пипеткой берут 0,02 мл этой суспензии и стерильным шпателем растирают на питательной среде. Затем, измельчают растительный материал в ступке, готовят кашицу из растений, содержащих фитонциды (чеснок, репчатьтй лук, хрен, редька, лимон), Кашицу помещают на агар в чашки Петри. После того как произведен посев и внесены фитонциды, чашки Петри помещают в термостат и оставляют там в течение 36–48 ч при температуре 25 оС. По истечении указанного срока их вынимают и просматривают, отмечая развитие бактерий в контроле и под воздействием разных фитонцидов. Результаты опыта записывают в таблицу.

36

Лабораторная работа 11 ОБРАЗОВАНИЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ГРИБОМ Aspergillus niger

В биотехнологии широко используется получение лимонной кислоты (С6Н8О7 ∙Н2О) с помощью микроорганизмов. Этим важным свойством обладает гриб Aspergillus nigеr.

Цель работы: изучить особенности образования лимонной кислоты грибом Aspergillus niger в равличных условиях выращивания.

Оборудование и материалы

20 %-й раствор сахарозы; 10 %-е растворы NН4NО3, КН2РО4, MgSO4, FeSO4; колбы емкостью 100 мл; цилиндры емкостью 100 мл; пипетки на 10 и 1 мл; препаровальные иглы; вата; культура гриба Aspergillus niger.

Ход работы

Готовят 200 мл полной питательной среды без микроэлементов. Стерильную мелассную среду, содержащую: сахарозу – 30,0 г/дм3, КН2PO4 – 0,16 г/дм3, NH4Cl – 2,2 г/дм3, MgSO4 7H2O – 0,25 г/дм3, ZnSO4 7Н2О – 0,005 г/дм3, засевают спорами гриба Aspergillus niger (например, штамм ВКПМ F-171) в колбах. Подращивание маточной культуры осуществляют в условиях аэрации при температуре 36 °С в течение 24 ч. Культивирование гриба проводят в течение недели при 28–30 °С. Затем определяют содержание лимонной кислоты в среде. К 10 см3 раствора добавляют две-три капли раствора лакмуса. Изменение цвета раствора из бесцветного в красный свидетельствует о наличии ионов водорода

(кислая среда). К 5 см3 раствора добавляют 0,5 см3 уксусного ангидрида и нагревают. Появление через 30±10 мин красного окрашивания свидетельствует о присутствии в растворе цитрат-ионов.

К 5 см3 раствора добавляют 1 см3 хлорида кальция, три капли бромтимола синего и 1 см3 разбавленной соляной кислоты. Затем добавляют гидроксид натрия до тех пор, пока цвет не изменится до чисто голубого, после этого кипятят раствор 3 мин, аккуратно перемешивая в течение всего периода нагревания.

37

Образование при кипячении белого кристаллического осадка цитрата кальция, нерастворимого в гидроксиде натрия, но растворимого в уксусной и соляной кислотах, свидетельствует о наличии в анализируемом растворе цитрат-ионов. Лимонная кислота выдерживает идентификационные тесты, если анализируемый раствор имеет кислую среду и содержит цитрат-ионы.

38

Лабораторная работа 12 ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ИЗ ЛИСТЬЕВ ТОМАТА

Каллус – это группа клеток, возникающая при травмах и защищающая место поранения вегентирующего растения (раневая паренхима). В ней накапливаются питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа. На питательных средах, при культивировании in vitro,

сбольшим содержанием ауксинов клетки экспланта могут дедифференцироваться. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Они просто деляться, образуя большую группу недеференцированных клеток. У различных видов растений это происходит по-разному. Причем чем менее дифференцирована клетка, тем легче получить каллус. Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, которые не имеют определенной структуры. Клетки каллуса либо сначала бесцветны, затем приобретают желтоватьтй оттенок. Различают каллусы рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками, средней плотности, с зонами меристематической активности и плотные,

сзонами редуцированного камбия и сосудов.

В биотехнологии чаще всего используют те виды растений, которые

ив обычных условиях легко укореняются, могут регенерировать и образовывать каллус. Клетки пасленовых культур легко переходят к делению, образуя быстрорастущую каллусную ткань. Поэтому большинство методов получения

икультивирования каллуса разработано для этих сельскохозяйственных культур. У томата каллусы можно получить практически из любой части растения. Обычно для получения каллусов используют семидольные листья, котрые выращивают на среде Мурасиге – Скуга (МС) с гормонами (2мг/л БАП, 0,2 мг/л ИУК).

Цель работы: освоить метод приготовления питательной среды для получения каллусной культуры томата.

39

Оборудование и материалы

Чашки Петри со стерильной питательной средой МС для индукцити каллусогенеза, 2 %-й раствор хлорамина, колбы со стерильной дистиллированной водой. Семена томата.

Ход работы

Приготовить питательную среду МС с добавлением гормонов 2 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 0,2 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК). Разлить среду в пробирки и простерилизовать в автоклаве. Семена томата поверхносно стерилизуют 2 %-м раствором хлорамина, промывают стерильной водой и сажают в стерильныепробирки. После появления семядольных листьев, их отрезают и, в условиях абсолютной стерильности, помещают на приготовленную среду МС. В течение 2 недель образуется крупный каллус и начинается дифференциация ткани.

40