Задания для самоконтроля

1. Для выявления вирусов из поступившего в лабораторию материала использовали культуры ткани и куриные эмбрионы. В культурах ткани вирусы обнаружить не удалось. Для пассирования вирусов в развивающихся куриных эмбрионах необходимо взять новую партию эмбрионов и заразить их исследуемым материалом.

1. На какой день инкубации используют куриные эмбрионы для выделения вирусов?

2. Куда вводят исследуемый материал при заражении куриных эмбрионов?

2. В вирусологической лаборатории для выделения вирусов заражены куриные эмбрионы. Одна часть эмбрионов была заражена на ХАО, другая часть в амниотическую, а третья – в аллантоисную полость. После культивирования вирусов эмбрионы вскрывают. Врачу необходимо дать заключение о выделении вирусов, и если они выделены, то какие вирусы могут быть выделены.

1. Как обнаруживали наличие вируса в ХАО? Какие вирусы могли быть обнаружены в ХАО?

2. Что является показателем накопления вирусов в аллантоисной и амниотической полости?

3. Какие вирусы накапливаются в аллантоисной и амниотической жидкости зараженных эмбрионов?

3. В вирусологическом отделении бактериологической лаборатории проводят выделение вирусов из материалов, взятых у больных. Вам необходимо подобрать тест-системы для выделения вирусов из присылаемых в лабораторию материалов.

1. Какие тест-системы используют при выделении вирусов из материалов, взятых у больных?

2. Какую из тест-систем наиболее широко используют во всех диагностических лабораториях?

3. Назовите разновидности наиболее широко используемой тест-системы.

4. В вирусологическую лабораторию доставили исследуемый материал, взятый у пациента инфекционного отделения. Вам необходимо указать реакции, которые используют для идентификации вируса.

1. Какие реакции используют для идентификации вирусов в культуре клеток?

5. В вирусологическую лабораторию доставили материал пациента. Вам необходимо указать реакции, которые используют для индикации вируса.

1. Какие реакции используют для индикации вирусов?

2. Какие реакции используют для экспресс-диагностики?

Глава 12

РЕТРОВИРУСЫ. ВИРУС ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Ретровирусы – это особые типы вируса, репродукция которых связана с ферментом – обратной транскриптазой (ревертаза или РНК‑зависимая ДНК-полимераза), обладающей тремя видами активности – обратной транскриптазы, РНК-азы и ДНК-полимеразы. После встраивания генома вируса клетка-хозяин обрабатывает вирусную ДНК как часть своего собственного генома, транскрибируя и транслируя вирусные гены вместе с собственными генами клетки, производя белки, необходимые для сборки новых копий вируса.

Семейство Retroviridae включает три подсемейства

1. Lentivirinae – возбудители медленных вирусных инфекций, в т.ч. ВИЧ.

2. Oncovirinae – онкогенные вирусы, с которыми связано превращение нормальных клеток в опухолевые.

3. Spumavirinae – «пенящие» вирусы, название которых связано с характерным «вспененным» видом инфицированных ими клеточных культур как результат интенсивного симпластообразования.

ВИЧ-инфекция – антропонозная медленная вирусная инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека, который поражает жизненно важные клетки иммунной системы человека, такие как Т‑хелперные клетки (в частности, CD4+ Т-клетки), макрофаги и дендритные клетки. Когда количество CD4+ Т-клеток снижается ниже критического уровня, клеточно-опосредованный иммунитет теряется, и организм становится все более восприимчивым к оппортунистическим инфекциям, что приводит к развитию синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа).

История ВИЧ-инфекции

Считается, что самый ранний ретроспективно описанный случай СПИДа произошел в Норвегии, в 1966 году.

Первая новость о «новой экзотической болезни» появилась 18 мая 1981 г. в гей-газете New York Native.

Впервые СПИД был клинически выявлен в 1981 г. в Соединенных Штатах. Первоначальные случаи были среди групп потребителей инъекционных наркотиков и мужчин-геев, без известной причины у них отмечались нарушения иммунитета, которые проявились симптомом пневмоцистной пневмонии, редкой оппортунистической инфекции, которая, как известно, встречается у людей с очень ослабленным иммунитетом. Вскоре после этого исследователи из Медицинской школы Нью-Йоркского университета изучали мужчин-геев, у которых развился ранее редкий рак кожи, называемый саркомой Капоши.

В центрах США по контролю и профилактике заболеваний не было официального названия для болезни. Общее название звучало как лимфаденопатия, заболевание, в честь которого первооткрыватели ВИЧ первоначально назвали вирус. Они также использовали саркому Капоши и оппортунистические инфекции – название, под которым в 1981 г. была создана целевая группа. В широкой прессе был введен термин GRID (gay-related immune deficiency), обозначающий связанный с гомосексуализмом иммунодефицит. Однако, после определения того, что СПИД встречается и среди гетеросексуальных пар, было принято, что термин GRID вводит в заблуждение, и СПИД был представлен на собрании в июле 1982 г. К сентябрю 1982 г. центры США по контролю и профилактике заболеваний начали использовать название СПИД.

В 1983 г. две отдельные исследовательские группы, возглавляемые американцем Робертом Галло и французскими исследователями Франсуазой Барре-Синусси и Люком Монтанье, независимо друг от друга заявили, что новый ретровирус, возможно, заражал больных СПИДом, и опубликовали свои результаты в том же номере журнала Science. Р. Галло утверждал, что вирус, который его группа выделила у человека, больного СПИДом, был поразительно похож по форме на другие человеческие Т‑лимфотропные вирусы (HTLV), которые его группа выделила первой. В 1987 г. Р. Галло признался, что вирус, который он якобы обнаружил в 1984 г., на самом деле был вирусом, присланным ему из Франции годом ранее. Группа Р. Галло назвала свой недавно выделенный вирус HTLV-III. Группа Л. Монтанье выделила вирус у пациента с отеком лимфатических узлов на шее и физической слабостью, двумя классическими симптомами первичной ВИЧ-инфекции. Опровергая отчет группы Р. Галло, Л. Монтанье и его коллеги показали, что основные белки этого вируса иммунологически отличаются от белков HTLV-I. Группа Л. Монтанье назвала выделенный ими вирус – вирусом, ассоциированным с лимфаденопатией (LAV). Поскольку эти два вируса оказались одинаковыми, в 1986 г. LAV и HTLV-III были переименованы в ВИЧ.

Другой группой, работавшей одновременно с группами Л. Монтанье и Р. Галло, была группа Джея А. Леви из Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Он независимо обнаружил вирус СПИДа в 1983 г. и назвал его ассоциированным ретровирусом со СПИДом (АРВ). Этот вирус сильно отличался от вируса, о котором сообщили группы Л. Монтанье и Р. Галло. АРВ-штаммы впервые показали гетерогенность изолятов ВИЧ, и некоторые из них остаются классическими примерами вируса СПИДа, обнаруженного в Соединенных Штатах.

Этиология

ВИЧ является представителем рода Lentivirus, входящего в семейство Retroviridae.

ВИЧ-1 и ВИЧ-2 являются родственными лимфотропными вирусами с цитопатическим эффектом и относятся к семейству ретровирусов, подсемейству медленных вирусов. ВИЧ обладает свойством выраженной генетической изменчивости. Благодаря высокой лабильности и склонности к мутациям, эволюция вируса обусловила его генетическое разнообразие.

Так, для ВИЧ-1 выделены четыре группы субтипов вируса. Основная группа М (от англ. main – главная), включает доминирующие на планете субтипы вируса, которые обозначают латинскими буквами алфавита от A до К. К группе О (от англ. outlier – изолированная часть) были отнесены субтипы вируса, которые очень сильно отличаются как от вирусов группы М, так и между собой. Вирусы группы O были обнаружены в 1990 г. и гораздо менее распространены, чем представители группы М. Их вклад в развитие глобальной эпидемии инфекции ВИЧ-1 составляет менее 1%, а распространение их в значительной степени ограничено Камеруном, Габоном и соседними африканскими странами. Третью группу N составляют новые штаммы ВИЧ, не отнесенные ни в группу М-, ни в группу О- (non-М, non-О). Вирусы данной группы были обнаружены в 1998 г. Они даже менее распространены, чем вирусы группы O-, и были зарегистрированы у отдельных больных в Камеруне. Наконец, вирус группы P был обнаружен в 2009 г. у камерунской женщины, живущей во Франции.

В отличие от ВИЧ-1 неоднородность ВИЧ-2 менее выражена. Определено, по крайней мере, 8 различных штаммов ВИЧ-2. По аналогии с ВИЧ-1, эти субтипы были названы буквами английского алфавита: А, В, С, D, E, F, G, H. При этом установлено, что значительное распространение имеют ВИЧ-2 только групп А и В. С момента своего первого открытия, ВИЧ-2 в значительной степени остается ограниченным Западной Африкой, его наиболее высокие показатели распространенности зарегистрированы в Гвинее-Бисау и Сенегале. Вирусная нагрузка, как правило, у больных ВИЧ-2 ниже, чем у ВИЧ-1-инфицированных лиц. Этим объясняют более низкую скорость передачи ВИЧ-2, практически полное отсутствие инфицирования от матери к новорожденному. Кроме того, у большинства людей, инфицированных ВИЧ-2, СПИД не развивается.

С одной стороны, чрезвычайная генетическая изменчивость вируса обусловливает низкую эффективность иммунного ответа, а также развитие у него устойчивости к воздействию противовирусных препаратов. Кроме того, высокая частота мутаций вируса существенно затрудняет создание вакцины. С другой стороны, склонность ВИЧ к быстрому генетическому изменению предоставляет нам уникальную возможность проникнуть в суть, когда и где СПИД берет свое начало. Молекулярные эпидемиологические исследования показали, что большинство, если не все типы ВИЧ-1 группы М, произошли от общего вируса-предка в районе Киншаса (до 1966 г  Леопольдвиль) – столице Демократической республики Конго (государство в Центральной Африке). Именно Киншаса является тем местом, где были обнаружены самые ранние штаммы ВИЧ-1 группы М-, предшественником которых явился SIV (Simian immunodeficiency virus, обезьяний вирус иммунодефицита), вызывающий инфекцию у шимпанзе. Таким образом, все имеющиеся к настоящему времени научно аргументированные данные указывают на район Киншаса/Леопольдвиль как колыбель пандемии ВИЧ-инфекции.

Эпидемиология

Распространенность

Пандемия ВИЧ-инфекции, распространившаяся по всем континентам, продолжает оставаться угрожающей для человечества трагедией. Распространенность заболевания среди населения различных стран составляет от менее 0,1% (Египет, Монголия и др.) до более 15–20% (регионы Южной Африки). Источником вируса является больной ВИЧ-инфекцией. Считается, что восприимчивость составляет 100%. Пути передачи: эпидемическое значение имеют половой (гетеро- и гомосексуальные контакты), парентеральный (употребление инъекционных наркотиков, гемотрансфузии, посредством инфицированного колюще-режущего инструментария и т.д.) и вертикальный (трансплацентарно, перинатально и постнатально) пути передачи. Факторами передачи являются кровь, семенная жидкость, вагинальный секрет, грудное молоко. Вирус обнаруживают в любых других биологических жидкостях организма больного, в том числе слюне, моче, слезе, потовых выделениях и т.д. Однако вследствие низких концентраций вириона в них они не представляют эпидемической опасности. Исключение составляют случаи, когда эти биологические жидкости содержат видимые невооруженным глазом включения крови.

Следует отметить, что ВИЧ неустойчив во внешней среде – инактивируется при нагревании до 56^оС за 30 минут, до 100^оС – за 1 минуту, обработкой дезинфицирующими средствами (70% этиловый спирт, 0,2% раствор гипохлорита натрия, 3% раствор перекиси водорода и др.).

Жизненный цикл ВИЧ

Вначале происходит связывание вириона с мембраной клетки‑мишени, затем инъекция содержимого капсида в клетку (рис. 12.1). Ключевую роль в обеспечении этого процесса отводят гликопротеинам gp120 и gp41 (для ВИЧ-1) и gp105/125 и gp36 (для ВИЧ-2), которые расположены в наружной оболочке вириона. Прикрепленный через gp120 (или gp105/125) к рецептору СD4+ клетки-мишени вирус далее с помощью белка gp41 (или gp36) сливается с мембраной поражаемой клетки. Важно, что для окончательного слияния вируса и мембраны необходим ко-фактор, которым является клеточный хемокиновый рецептор CCR5 (или CXCR4). После инъекции вирусного капсида в клетку при помощи фермента обратной транскриптазы на основании РНК синтезируется необходимая для размножения вирусная ДНК. Посредством фермента интегразы ДНК интегрируется в геном клетки, после чего начинается транскрипция вирусных полипептидов. Трансляция и рассечение вирусных полипептидов на функционирующие белки обеспечивается протеазой. Далее происходит сборка дочерних вирионов и выход их из клетки.

Рис. 12.1. Жизненный цикл ВИЧ (адаптировано по M.D. Marsden, J.A. Zack, 2013)

Патогенез

Заболевания в основном определяется способностью ВИЧ поражать клетки организма человека, несущие на своей поверхности CD4+ рецепторы. К данным клеткам относят Т-хелперы-индукторы, а также часть Т-цитотоксических лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, В‑лимфоцитов, тимоцитов, мегакариоцитов, клеток нервной системы (микроглиальные клетки, нейроны), эндотелиоцитов. В связи с этим становится очевидным, что в основном механизмы патогенеза и, соответственно, клиническая характеристика заболевания обусловлены иммунотропными и нейротропными свойствами ВИЧ и способностью поражать иммунную и нервную системы организма человека.

Следует отметить, что поражение иммунной системы при ВИЧ инфекции носит системный характер, проявляясь глубокой супрессией Т^- и В- звеньев иммунитета. В ходе развития ВИЧ инфекции наблюдаются закономерные изменения гиперчувствительности немедленного и замедленного типа, гуморального иммунитета и факторов неспецифической защиты, функциональной активности лимфоцитов и моноцитов/макрофагов. По мере прогрессирования иммунных нарушений это обусловливает развитие у больных различных инфекционных процессов, в первую очередь, активацию эндогенных инфекций (вирусных, грибковых и т.д.).

Кроме того, установлено, что вирусный белок р15 оказывает супрессивное действие на продукцию Т клетками ИЛ-2 и γ-интерферона, что приводит к снижению активности макрофагов, цитотоксичности CD8+ лимфоцитов и естественных киллеров. Вследствие этого нарушаются механизмы противоопухолевого иммунитета и создаются условия для развития злокачественных новообразований. В инициации опухолевого роста, а именно саркомы Капоши, цервикального рака, лимфом ключевую роль играет реактивация отдельных вирусов – соответственно герпесвируса 8 типа, вирусов папилломы человека, вируса Эпштейна-Барр.

Вторым после иммунной системы объектом для воздействия ВИЧ является центральная нервная система. Это обусловлено способностью вируса прямо инфицировать нейроны, астроциты и микроглию. Цитопатогенное воздействие ВИЧ на клетки нервной системы приводит к широкому спектру неврологических нарушений (снижение памяти, нарушение логики мышления, нарушение координации движений и т.д.). Причем, следует отметить, что у 4–5% больных первые признаки манифестации ВИЧ-инфекции регистрируются именно со стороны нервной системы.

Клиника

Патогенез инфекции носит фазовый характер, что находит отражение в соответствующих изменениях в состоянии больного и появлении клинических признаков заболевания. Для понимания динамики развития патологического процесса при ВИЧ-инфекции удобна классификация ее стадий, предложенная ВОЗ в 1992 году. Согласно данной классификации, выделяют: инкубационный период, характеризующийся внедрением и активной репликацией вируса в клетках мишенях. Вслед за инкубационным периодом чаще всего уже через 2–4 недели развивается клиническая I стадия – острая ВИЧ-инфекция (острый ретровирусный синдром), которая сопровождается лизисом вирусом клеток-мишеней, вирусемией и транзиторным снижением количества в крови CD4+ лимфоцитов. В зависимости от состояния реактивности организма и степени репликативной активности ВИЧ, вышеуказанная стадия в среднем длится 5–14 дней и может протекать либо бессимптомно, либо у 20–50% больных в виде неспецифической клинической манифестации различной степени тяжести.

Клинические проявления острой ВИЧ-инфекции отличаются большим полиморфизмом. У больных нарушается общее состояние (лихорадка, вялость, слабость, потеря аппетита, потливость), что сочетается с фарингитом, тонзиллитом, увеличением лимфатических узлов. Отмечаются признаки поражения нервной системы (головная боль, светобоязнь, периферическая нейропатия, радикулопатия и др.). Со стороны органов желудочно-кишечного тракта возможны тошнота, рвота, диарея, гепатолиенальный синдром, кандидоз слизистой рта. Острая ВИЧ‑инфекция может проявляться изменениями на коже (пятнисто-папулезня сыпь, розеолезная сыпь и т.д.), в том числе обусловленными реактивацией герпесвирусов (опоясывающий лишай и др.). У 15–30% больных течение острой инфекции напоминает клиническую картину инфекционного мононуклеоза (мононуклеозный синдром). Реже острая ВИЧ-инфекция имеет симптоматику, характерную для острой респираторной вирусной инфекции (гриппоподобный синдром).

После стадии острой ВИЧ-инфекции развивается длительная латентная вирусная инфекция – бессимптомная стадия (клиническая стадия II) длительностью до 15 и более лет. У 2/3 больных на этой стадии отмечается безболезненное увеличение лимфатических узлов – чаще всего задне- и переднешейных, над- и подключичных, подмышечных. Несмотря на кажущееся благополучие в состоянии здоровья ВИЧ-инфицированного, в этот период заболевания отмечается постепенное снижение количества в крови CD4+ лимфоцитов (в среднем на 50–70 кл/мкл в год).

У ВИЧ‑инфицированного при уровне Т-хелперов-индукторов <500 кл/мкл появляются первые признаки пре-СПИДа (клиническая стадия III) – стадии, длительность которой составляет около 1–2 лет. В эту стадию нарушается общее состояние больного (лихорадка, общая слабость, потливость, снижение аппетита и т.д.), появляется склонность к повторным интеркуррентным заболеваниям. Часто на коже отмечаются рецидивирующие бактериальные инфекции (пиодермия, фурункулы, карбункулы, гидрадениты и др.). У большинства больных регистрируется грибковая инфекция (кандидоз кожи и слизистых рта и гениталий, себорейный дерматит, разноцветный лишай и др.). В клинической картине пре-СПИДа характерны признаки реактивации герпесвирусов (лабиальный и генитальный герпес, опоясывающий лишай, волосистая лейкоплакия языка). У части больных на этой стадии отмечаются нарушения со стороны нервной системы.

Стадия пре-СПИД предшествует терминальной стадии ВИЧ‑инфекции – СПИД (клиническая стадия IV), которая характеризуется дальнейшим прогрессированием иммунодефицита со значительным снижением уровня CD4+ лимфоцитов (<200 кл/мкл) и более разнообразной и выраженной клинической картиной. В результате нарастающей и необратимой иммуносупрессии у больного развиваются тяжелые оппортунистические инфекции, злокачественные новообразования, отмечается прогрессирующее поражение центральной нервной системы, что приводит к тяжелой патологии жизненно важных органов и систем организма человека и летальному исходу. Длительность терминальной стадии, как правило, не превышает 6–12 месяцев.

Специфическая диагностика (Схема 24)

Схема 24