11.2. Методы диагностики вирусных инфекций
При диагностике вирусных инфекций используют экспресс-метод, вирусологический, серологический, молекулярно-генетический,
реже вирусоскопический и биологический.
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций направлены на:
микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала;
обнаружение антигенов в исследуемом материале;
выделение и идентификацию возбудителя («золотой стандарт»);
обнаружение и определение титров противовирусных антител.
Экспресс-метод
Экспресс-метод позволяет быстро и надежно (с высокой чувствительностью и специфичностью) обнаружить вирус или его антигены в исследуемом материале.
При диагностике вирусных инфекций применяют:
прямую РИФ;
иммуноблоттинг (ВИЧ);
ПЦР и гибридизацию ДНК in situ;
реакцию гемадсорбции на твердой основе;
РОНГА (редко);
ИФА с индикаторными полосками (лунками) для поиска антигенов;
иммунную электронную микроскопию (обработка препарата специфической противовирусной сывороткой и электрон-контрастным веществом, после чего при положительном результате при электронной микроскопии видны скопления вирусных частиц);
встречный иммуноэлектрофорез (образование линий преципитации в агаре между лунками с антителами и антигенами при проведении электрофореза).
Вирусологический метод
Вирусы культивируют в куриных эмбрионах (КЭ), культурах клеток (КК) и в лабораторных животных. Этот метод является длительным, трудоемким и затратным, но в то же время считается «золотым стандартом» диагностики.
Культуры клеток, используемые для культивирования вирусов
Первичные
получают из ткани путем механического измельчения и обработки протеолитическими ферментами;
наиболее распространены культуры клеток почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека; срок жизни органичен (2–3 недели).
Полуперевиваемые
способны размножаться десятилетиями и выдерживать 50–100 пассажей;
наиболее распространены культуры фибробластов эмбриона человека.
Перевиваемые:
обладают потенциальным бессмертием;
большинство происходят из опухолевых клеток;
наиболее распространены культуры HeLa (карцинома шейки матки), Hep-2 (карцинома гортани), RH (почка человека).
Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды обеспечивают активное размножение клеток для формирования монослоя, а поддерживающие – переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.
Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят взвесь материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов.
После 30–60 минут контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.
Индикация и идентификация вирусов в культуре клеток
Индикация вирусов – процесс установления наличия их в культуре без уточнения видовой принадлежности.
Способы индикации вирусов:
Цветная реакция или цветная проба (ЦП).
Определение цитопатического действия (ЦПД).
Определение бляшкообразования (БО).
Реакция гемадсорбции (РГадс).
Результат, получаемый при индикации вирусов:
Цветная реакция или цветная проба:
в среду вносят индикатор pH, который при нормальной жизнедеятельности клеток изменяет окраску из-за накопления в среде различных метаболитов;
при заражении вирусом клеточный метаболизм резко снижается, и окраска индикатора не изменяется.
Определение цитопатического действия, т.е. характерного нарушения морфологии клеток, обнаруживаемого при микроскопии культур (рис. 11.3):
гигантские многоядерные клетки – симпласты (парамиксовирусы);
скопления набухших круглых клеток (аденовирусы);
крупнозернистая дегенерация (герпесвирусы);
дегенерация клеток с вакуолизацией (ретровирусы, флавивирусы);
отсутствие ЦПД (также может быть диагностическим признаком).
Рис. 11.3. Индикация вирусов на КК. Цветная проба и цитопатическое действие на культуре клеток
Определение бляшкообразования:
монослой КК обработывают исследуемым материалом и покрывают тонким слоем питательной среды с 1,5% агара и красителем нейтральным красным;
через несколько дней культивации в термостате обнаруживают бляшки – участки монослоя, на которых клетки разрушены вирусом; выглядят как зоны просветления;
количество бляшек соответствует числу вирусных частиц;
могут подсчитываться для определения цитопатогенности вируса в бляшкообразующих единицах.
Реакция гемадсорбции:
КК обрабатывают исследуемым материалом и добавляют взвесь эритроцитов;
при наличии вируса в клетках на них будут адсорбироваться эритроциты.
На рисунке 11.4 представлена положительная реакция интерференции (при отсутствии ЦПД).
Рис. 11.4. Индикация вирусов на КК. Реакция гемадсорбции
(в опыте – положительная, в контроле – отсутствие гемадсорбции)
Идентификация вирусов – это процесс надежного установления их видовой принадлежности. Идентификацию проводят серологическим методом (реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция торможения гемадсорбции (РТГадс), РН, РСК, РНГА, ИФА, непрямая РИФ, РИА) и молекулярно-генетическим методом (ПЦР, молекулярная гибридизация).
Реакция нейтрализации. Неизвестный вирус смешивают с известными антисыворотками (по отдельности) и вносят в монослой клеток. При отрицательном результате (несовпадение сыворотки и вируса) клетки поражаются и гибнут; при положительном результате, т.е., когда сыворотка подобрана верно – гибели клеток не наблюдают.
Реакция интерференции. Реакцию используют для вирусов, которые не оказывают видимого ЦПД (не убивают и не изменяют пораженные клетки); сперва ее проводят так же, как РН, а в конце к новой культуре добавляют еще и известный вирус с выраженным ЦПД; если ЦПД не проявилось, это означает, что известный вирус не смог поразить клетки, так как они уже были поражены исследуемым (неизвестным вирусом), то есть наблюдается явление интерференции; если же ЦПД в монослое проявилось, это означает, что известный вирус свободно поразил клетки, а исследуемый вирус был успешно нейтрализован антисывороткой, то есть примененная антисыворотка соответствует исследуемому вирусу.
Реакцию торможения гемагглютинации применяют для вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью (гриппа, кори, краснухи и др.). Культуру возбудителя смешивают с известной антисывороткой и эритроцитами; наличие гемагглютинации говорит о несоответствии сыворотки и возбудителя, а отсутствие (т.е. торможение) гемагглютинации – о соответствии; в варианте реакции с торможением гемадсорбции (РТГадс) эритроциты вносят в клеточную культуру, и при несоответствии сыворотки наблюдают под малым увеличением микроскопа прилипание (адсорбцию) эритроцитов на клетках.