Микробиологическая диагностика дифтерии

Эти результаты микроскопического исследования рассматривают как ориентировочные, так как в препарате могут быть и другие зернистые микробные клетки

При окраске по Граму зерна волютина не проявляются, но грамположительная окраска и характер расположения дифтерийных палочек позволяют косвенно отличить их от непатогенных коринебактерий, располагающихся параллельно друг другу (рис. 7.1).

А Б

Рис. 7.1. Способы выявления зерен волютина у коринебактерий

микроскопия иммерсионным объективом светового микроскопа

(источник заимствования – ресурсы сети Интернет)

А. Окраска по Леффлеру. Щелочная метиленовая синька Леффлера – 3‑5 минут. Промывание, высушивание, микроскопия.

Б. Окраска по Нейссеру. Уксуснокислая синька Нейссера – 1 минуту. Промывание водой. Раствор Люголя – 0,5 минут. Не промывая водой – везувин 1 минуту. Промывание, высушивание, микроскопия.

Бактериологический

Бактериологический метод – основной метод диагностики дифтерии, включающий выделение чистой культуры микроорганизмов, их идентификацию с обязательной проверкой способности коринебактерий синтезировать экзотоксин.

Исследуемый материал высевают в чашках Петри на кровяной теллуритовый агар и помещают в термостат. В зависимости от биовара на кровяном теллуритовом агаре могут вырасти большие колонии серовато-черного цвета, плоские, шероховатые, радиально исчерченные, с зубчатыми краями (gravis), мелкие выпуклые, блестящие и черные колонии с гладкой поверхностью и ровными краями (mitis), мелкие плоские колонии с более темным центром, иногда с неровными краями (intermedius) (рис. 7.2).

А

Б

Рис. 7.2. Коринебактерии на питательных средах и в мазке из чистой культуры

А – колонии Corynebacterium diphtheriae 1 – gravis, 2 – mitis; Б – мазок из чистой культуры, окраска по Нейссеру

(источник заимствования – ресурсы сети Интернет)

Для получения чистой культуры микроорганизмов часть подозрительной колонии пересевают на скошенную свернутую сыворотку (среда Ру, Леффлера). После инкубации в термостате на этих средах наблюдается рост дифтерийной палочки в виде «шагреневой кожи» (колонии микроорганизмов сливаются, но центр их остается возвышенным). Определив под микроскопом чистоту выделенной культуры, идентифицируют микроорганизмы путем изучения биохимических свойств. Для этого их засевают в среды Гисса (глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза, сахароза), в среду с крахмалом, гликогеном (рис. 7.3).

Ферментируют глюкозу (+), мальтозу (+) Не ферментируют сахарозу (–) Не образуют уреазу (проба Заксе на мочевину – отрицательная) Обладают цистиназной активностью (расщепляют цистин на среде Пизу)

Рис. 7.3. Биохимические свойства коринебактерий на средах Гисса

(источник заимствования – ресурсы сети Интернет)

Для выявления цистиназы делают посев в специальную среду с цистином и уксуснокислым свинцом. Отмечают почернение среды по ходу посева.

Для определения способности микроба расщеплять мочевину делают посев в бульон с 1% мочевиной и индикатором крезолротом. Покраснение среды не отмечают, так как возбудители дифтерии не имеют уреазной активности.

Токсигенность дифтерийной палочки можно обнаружить как in vivo, так и in vitro.

In vivo. Морским свинкам внутрикожно вводят фильтрат бульонной культуры дифтерийных бактерий. Если бактерии вырабатывают экзотоксин, то в месте введения культуры образуется некроз ткани.

Наибольшее распространение получили опыты in vitro. При этом используют реакцию преципитации в геле. На поверхность питательной среды в центре чашки Петри размещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой. Культуры исследуемых микроорганизмов высевают бляшками с обеих сторон полоски. Контролем является известный токсигенный штамм дифтерийной палочки. Чашки с посевами инкубируют при 37°С, результаты учитывают через 24–48 часов. Если дифтерийные палочки продуцируют экзотоксин, то он, диффундируя в агар и встречаясь с антитоксином, образует четкую линию преципитата, которая сливается с линией преципитата токсигенного (контрольного) штамма. Изучение вышеперечисленных свойств выделенной культуры позволяет отличить дифтерийную палочку от других коринебактерий (дифтероидов и псевдодифтерийных коринебактерий) (рис. 7.4).

Компоненты реакции: 1.Чашка Петри со средой 2.Токсигенная культура C. diphtheriae (контроль «+») 3.Нетоксигенная культура C. diphtheriae – в центре (контроль «–») 4.Исследуемая культура 5.Антитоксическая сыворотка (нанесена на фильтровальную бумагу)

Рис. 7.4. Реакция преципитации в геле (Элек тест)

определение токсигенности коринебактерий (схематическое изображение и фото)

(источник заимствования – ресурсы сети Интернет)

Молекулярно-генетический

ПЦР – обнаружение гена токсигенности tox+ в ДНК выделенной культуры при клинически подозрительных поражениях.

Серологический

РПГА, ИФА – для измерения уровня сывороточных антител. По предложению ВОЗ, минимальный защитный уровень антитоксических антител – 0,1 МЕ/мл (напряженность противодифтерийного иммунитета). Реакция агглютинации: сыворотки больных разводят 3% раствором натрия хлорида в соотношении 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600. К разведениям сыворотки добавляют специально приготовленный диагностикум (дифтерийная культура, отмытая 3% раствором натрия хлорида и убитая 0,2% раствором формалина). Реакцию считают положительной при разведении сыворотки не менее 1:100. Используют также реакцию пассивной гемагглютинации с эритроцитарным бактериальным диагностикумом. Диагностическим считают титр 1:8 и выше, если он регистрируется на второй неделе от начала болезни.

Принципы лечения

Режим постельный на период острых явлений: при субтоксической и токсической I степени – 21 день, при токсической II степени – до 40 дней, при тосической III степени – до 50 дней. Диета – щадящая.

Специфическая терапия

Антитоксическая противодифтерийная сыворотка нейтрализует дифтерийный токсин, циркулирующий в крови. Торговое название: «Сыворотка противодифтерийная лошадиная очищенная концентрированная жидкая» (раствор для внутримышечного и подкожного введения – по 10000 ME в ампулах), ранее утвержденными дозами, актуальными на сегодняшний день.

Дозы сыворотки определяются формой дифтерии.

АПДС вводят до 5-го дня болезни!

АПДС вводят повторно до исчезновения или значительного уменьшения налетов.

Выжидание введения АПДС допустимо при легких локализованных формах.

При подозрении на дифтерийный круп и при токсических формах дифтерии сыворотку вводят немедленно!

Этиотропная терапия

Антибактериальную терапию (одномоментно с АПДС) назначают по чувствительности возбудителя (макролиды, защищенные пенициллины, цефалоспорины).

Лечение бактерионосителей

Антибактериальная терапия – эритромицин, рифампицин – в средних возрастных дозах, курс 5–7 дней. Выявление и лечение хронической патологии ЛОР-органов.

Принципы профилактики

Неспецифическая профилактика

Значимым компонентом профилактики дифтерии являются противоэпидемические мероприятия в очаге инфекции.

• Больных дифтерией и больных с подозрением на заболевание госпитализируют в стационар инфекционной больницы. В стационаре больноого помещают в боксированную палату. Выписку больного из стационара осуществляют после получения двух отрицательных результатов бактериологического исследования, проведенных спустя 2 дня после окончания антибиотикотерапии. Бактериологическое исследование проводят с интервалом в два дня.

• После изоляции больного в очаге проводят заключительную дезинфекцию.

• Контактных лиц врач осматривает и обследует на бактерионосительство. После проведения дезинфекции в очаге и получения отрицательных результатов бактериологического исследования контактных детей допускают к посещению детских учреждений, а взрослых – к работе в детских коллективах и предприятиях общественного питания. Наблюдение за контактными лицами длится 7 дней с момента проведения заключительной дезинфекции.

• Выявленные бактерионосители подлежат лечению.

Специфическая профилактика

• Активная иммунизация дифтерийным анатоксином, который входит в качестве составляющего компонента в комплексные вакцины, содержащие коклюшную вакцину, дифтерийный и столбнячный анатоксины.

• Детям с неблагоприятным аллергическим фоном вводят вакцину АДС-М-анатоксин, который отличается уменьшенным содержанием антигенов.

• Первичную вакцинацию проводят с 3-месячного возраста АКДС-вакциной трехкратно с интервалом 45 дней.

• Первую ревакцинацию проводят вакциной АКДС через 12–18 месяцев после третьей вакцинации.

• Лица, не подвергавшиеся иммунизации против дифтерии, в случае контакта с больным или носителем токсигенной дифтерийной палочки подлежат немедленной вакцинации по полной схеме в соответствии с возрастом.