Микробиологическая диагностика туберкулеза

К исследуемому материалу приливают двойной объем 6% серной кислоты, встряхивают 10 минут, центрифугируют, сливают и осадок нейтрализуют добавлением 1–2 капель 3% NaOH или отмывают физиологическим раствором (убивают кислоточувствительные микроорганизмы) – после чего посев на специальные среды (растут медленно).

Ускоренные методы

Метод микрокультур (метод Прайса). Наносят толстым слоем материал на стекло, обрабатывают 5 минут 6% серной кислотой, удаляют кислоту физиологическим раствором. Препараты помещают во флаконы с цитратной кровью. Посевы ставят в термостат. Через 48–72 часов препарат извлекают, фиксируют и окрашивают по Цилю–Нильсену.

Глубинный рост в гемолизированной крови (метод Школьниковой). В пробирки с цитратной кровью вносят материал, обработанный серной кислотой и промытый изотоническим раствором хлорида натрия. Через 6–8 дней пребывания в термостате среду центрифугируют и из осадка делают мазки.

Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финн-2, среда Новая, Огавы) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред для выделения M. tuberculosis. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (агар 7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от 2 до 4 недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии культур, чем на яичных средах (рис. 5.2).

Рис. 5.2. Бородавчатый рост микобактерий туберкулеза на среде Левенштейна-Йенсена

(источник заимствования – ресурсы сети Интернет)

На жидких питательных средах возбудитель туберкулеза растет, образуя пленку. Период генерации у M. tuberculosis равен 14–15 часов. Этим объясняется медленный рост и длительность выделения культуры. Так для получения роста M. tuberculosis требуется 12–25 дней, а для М. bovis – 24–40 дней. При пересевах культуры вырастают за 10–21 день. Оптимальная температура 37ºС, рH 7,0.

Возбудители туберкулеза – аэробы, обладают каталазной активностью, которая теряется при температуре +68ºС в течение 10–30 минут – в отличие от других микобактерий. Восстанавливают нитраты, обладают уреазой, не способны превращать ниацин в ниацинрибонуклеотид и накапливать его в среде. М. bovis обладает уреазой, не восстанавливает нитраты, не накапливает ниацин, не продуцирует никотинамидазу. Имеют пероксидазу в отличие от некоторых патогенных и атипичных микобактерий.

Серологический

Реакция связывания комплемента (РСК), РНГА Миддбрука–Дюбо, РА. Диагностическим считается титр 1:8.

Радиоимунный метод, иммуноблотинг, реакция агрегат‑гемагглютинации (для обнаружения циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК)).

Среди современных методов серодиагностики туберкулеза наибольшее распространение получили ИФА и РИА.

Биологический

Используют для определения вирулентности – заражают морскую свинку, через 6 недель производят пробу Манту и забивают через 4 месяца (о вирулентности судят по количеству бугорков во внутренних органах, продолжительности жизни животных, уменьшению массы).

Молекулярно-генетический

К современным методам диагностики туберкулеза относят ПЦР.

Оптимальным соотношением чувствительности, специфичности, себестоимости и трудоемкости проведения анализа отличается технология биочипов.

Метод включает двухэтапную мультиплексную амплификацию генов, мутации в которых приводят к возникновению устойчивости, с включением флюоресцентной метки.

Полученные меченные ампликоны гибридизируют с иммобилизированными на микрочипе олигонуклеотидными зондами в течение 12 часов.

Дискриминирующие олигонуклеотиды, размещенные на биочипе, способны обнаружить мутации в генах rpoB (для рифампицин-резистентных штаммов), katG, inhA и межрегуляторной области генов ahpC–oxyR (для изониазид-резистентных штаммов). Результаты гибридизации регистрируют на портативном анализаторе биочипов с соответствующим программным обеспечением «Биочип–ИМБ», Россия.

Аллергологический

Проба Манту с туберкулином для определения инфицированности людей внутрикожно, учет через 24–48–72 часа.

Пробу оценивают следующим образом:

• менее 1 мм – результат отрицательный;

• 2–4 мм – результат сомнительный;

• 5 мм – проба положительная.

Принципы лечения

При лечении туберкулеза следует соблюдать ряд правил: начать как можно раньше, включать не менее двух препаратов (комбинация из двух препаратов обычно позволяет преодолеть химиорезистентность возбудителя), длительность (в связи с длительной продолжительностью жизни у микобактерий) и непрерывность.

• Препараты первого ряда: изониазид, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид, рифампицин.

• Альтернативные средства (при неэффективности препаратов первого ряда) – канамицин, циклосерин, парааминосалициловая кислота, этионамид, виомицин, капреомицин и тиоацетазон.

Принципы профилактики

Специфическая профилактика

Вакцинацию осуществляют в соответствии с календарем профилактических прививок. Новорожденные – на 37-й день жизни. Ревакцинация – дети 67 лет. При отсутствии вакцинации против туберкулеза в родильном доме она может быть проведена в возрасте до 7 лет туберкулиноотрицательным детям.

• Вакцина БЦЖ – культура живых микобактерий аттенуированного штамма БЦЖ-1, лиофильно высушенного в 1,5% растворе глютамината, содержит 1,0 мг вакцины БЦЖ (20 доз по 0,05 мг препарата).

• Вакцина БЦЖ-М – культура живых микобактерий аттенуированного штамма БЦЖ-1, содержит 0,5 мг вакцины БЦЖ (20 доз по 0,025 мг препарата).