Микробиологическая диагностика сибирской язвы

Бактериологический

Возбудитель сибирской язвы – аэроб, факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста 35–36°C, колебания 12–45°С. Он малотребователен в отношении питания, растет на большинстве общепринятых в лабораториях питательных средах: МПА, МПБ, мясопептонном желатине. рH 7,2–7,6. Рост на этих средах настолько характерен, что имеет диагностическое значение.

Этапы выполнения

1. Материал для исследования высевают на чашки Петри с мясопептонным агаром. Если исследуют кровь, то ее предварительно засевают в мясопептонный бульон, выдерживают в термостате в течение 18–24 часов при температуре 37°С.

2. Через сутки на МПА образует R-формы колоний: большие (3–5 мм) матовые зернистые шероховатые колонии с неровным краем, от краев колоний отходят пучки нитей, которые под микроскопом выглядят как локоны или львиная грива (рис. 3.4). В бульоне возбудитель сибирской язвы растет, образуя осадок в виде комочка ваты, бульон при этом остается прозрачным.

А

Б

Рис. 3.4. Колонии возбудителя сибирской язвы на плотных питательных средах

А – на мясопептонном агаре, Б – на кровяном агаре

(источник заимствования – ресурсы сети Интернет)

3. Из одной части подозрительной колонии готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Вторую часть пересевают на скошенный агар для получения большого количества чистой культуры микробов.

4. Через сутки инкубации в термостате выросшие на скошенном агаре микробы проверяют на чистоту и продолжают идентифицировать путем изучения биохимических свойств (в «пестром ряду» – расщепление глюкозы, лактозы, мальтозы до кислоты без газа, при посеве уколом в столбик желатина – характерный рост по ходу укола, напоминает елочку, перевернутую вниз вершиной). В дальнейшем верхняя часть желатины разжижается, образуя воронку (рис. 3.5).

1	2	3	4

Рис. 3.5. Рост возбудителей сибирской язвы на жидких, полужидких и плотных питательных средах

1 – в МПБ; 2 – в МПЖ; 3 – в сывороточном агаре; 4 – рост на МПА

(источник заимствования – ресурсы сети Интернет)

Молоко свертывается через 3–4 дня, а затем сгусток пептонизируется, разжижается. Выделяется аммиак и накапливается бурый пигмент в связи с окислением тирозина. Под влиянием 0,5‑0,05 ед/мл пенициллина, добавленного к питательной среде, палочки превращаются в сферопласты, и через 3–6 часов вместо обычных бацилл – шарообразные образования, напоминающие при микроскопии жемчужные ожерелья (рис. 3.6). Изучают свойства лизировать эритроциты; определяют чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу.

Рис. 3.6. Реакция «жемчужного ожерелья» на агаре с пенициллином

(источник заимствования – ресурсы сети Интернет)

Во время проведения бактериологического метода обязательна проверка выделенной чистой культуры микробов на патогенность для лабораторных животных, потому что в природе есть лжепалочки сибирской язвы, антракоидов, которые очень похожи по многим признакам на Bacillus anthracis, но не вызывают заболевание у животных и человека (табл. 3.2).

Таблица 3.2

Признаки B. anthracis, псевдосибиреязвенных микробов и антракоидов

Название микроба	Подвижность	Капсула	Рост в бульоне	Гемолиз	Лакмусовая сыворотка	Патогенность для животных
B. anthracis			В виде кусочков ваты, на дне бульон остается прозрачным		Краснеет	Патогенная
B. pseudo–anthracis	Слабая		Бульон мутнеет, на дне крошкообразный осадок, пленка на поверхности		Синеет	В больших дозах иногда патогенная для мышей
B. anthra–coides	Слабая		Бульон мутнеет, на дне крошкообразный осадок, пленка на поверхности		Синеет	В больших дозах иногда патогенная для мышей
B. subtilis			Пленка на поверхности, среда мутнеет		Синеет	Не патогенная

Биологический

Готовят эмульсию исследуемого материала в стерильном физиологическом растворе и вводят подкожно белым мышам, морским свинкам или кроликам. При наличии в материале B. аnthracis мыши и морские свинки погибают через 24–36 часов, кролики – через 48–72 часа. При вскрытии погибших животных наблюдают увеличенные органы вследствие застоя крови. Особенно резко изменена селезенка. В мазках из органов и крови обнаруживают палочки сибирской язвы с хорошо выраженной капсулой.

Биологический метод позволяет ускорить диагностику. Его используют также в тех случаях, когда материал для исследования сильно загрязнен посторонней микрофлорой, особенно гнилостной.

Аллергологический

Для диагностики сибирской язвы применяют специфический препарат – антраксин, с которым ставят внутрикожную аллергическую пробу на ладонной поверхности предплечья. В случае положительной реакции через 24 часа в месте введения антраксина появляется гиперемия и инфильтрат размером более 15 мм. Проба может быть положительной уже на первой неделе заболевания и долго сохраняется после выздоровления, поэтому может использоваться для ретроспективной диагностики.

Серологический

При исследовании трупного материала, шкуры животных, шерсти ставят реакцию термопреципитации Асколи для выявления С-антигена микробов. Сибиреязвенные бациллы обычно не гемолизируют бараньи эритроциты в отличие от сапрофитных бацилл, дающих быстрый гемолиз.

Постановка реакции термопреципитации Асколи для выявления

антигена возбудителя сибирской язвы

Используют для выявления термостабильного антигена возбудителя в различных объектах животного происхождения (шерсть, кожа и др.). Антиген извлекают кипячением исследуемого субстрата в физиологическом растворе с последующим фильтрованием.

Материал для исследования измельчают, заливают десятикратным объемом физиологического раствора и кипятят в течение 15 минут. Полученный термоэкстракт фильтруют до полной прозрачности жидкости. В пробирки малого диаметра вносят 0,5 мл преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, а затем осторожно по стенке пробирки пастеровской пипеткой наслаивают на нее 0,5 мл полученного экстракта исследуемого материала. Если в полученном экстракте находится С‑антиген возбудителя сибирской язвы, то на границе двух жидкостей через 2–5 минуты образуется кольцо преципитата беловатого цвета. Реакция Асколи отличается высокой чувствительностью.

Во избежание ложноположительного результата реакции ставят контроли:

1. Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + стандартный специфический преципитиноген.

2. Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + физиологический раствор.

3. Нормальная лошадиная сыворотка + исследуемый термоэкстракт.

Первый контроль должен быть положительным, остальные – отрицательными.

Постановка ИФА для быстрого выявления антигенов возбудителя в исследуемом материале

В лунку планшета из полистирола, содержащего специфические антитела, адсорбированные на ее поверхности, вносят исследуемый материал и оставляют на 30 минут при комнатной температуре.

Затем лунку промывают забуференным физиологическим раствором и вносят на 30 минут специфическую сыворотку, антитела которой мечены ферментом, например, пероксидазой хрена. Лунку снова промывают забуференным физиологическим раствором и вносят на 30 минут субстрат для выявления фермента на образовавшемся комплексе Аг+Ат.

Для выявления фермента пероксидазы хрена используют ортофенилендиамин с перекисью водорода. Добавление субстрата приводит к тому, что он подвергается воздействию пероксидазы, фиксированной на комплексе Аг+Ат. Продукты реакции, образующиеся в лунке, приобретают желтую окраску, интенсивность которой может быть определена путем фотометрирования.

Принципы профилактики

Неспецифическая

Профилактические мероприятия проводят в тесном контакте с соответствующими ветеринарно-санитарными мерами:

• Изоляция животных больных, а также подозрительных на сибирскую язву.

• Сжигание трупов погибших животных и зараженных объектов (навоз, подстилка).

• Обеззараживание заболоченных участков почвы.

Специфическую профилактику применяют только для определенных групп населения. Используют живую сибиреязвенную вакцину санитарно-технический институт (СТИ), полученнную Н.Н. Гинсбург и А.Л. Тамариным; гипериммунную противосибиреязвенную сыворотку или гаммаглобулин.

Принципы лечения

Антибиотикотерапия: пенициллин, тетрациклин, биомицин и др. Хороший терапевтический эффект – внутривенное введение больших доз анибиотиков.