Микробиологическая диагностика бруцеллеза
Микроскопический
Из исследуемого материала готовят мазок и красят сначала карболовым фуксином (разведение 1: 5) в течение 3 минут. Затем препарат промывают водой и дополнительно окрашивают 2% водным раствором метиленовой синьки в течение 5 минут. При микроскопии обнаруживают бруцеллы на голубом фоне в виде коротких палочек с закругленными концами красного цвета.
Бактериологический
Этапы выполнения
Исследуемый материал засевают в печеночный бульон или мясопептонный бульон (МПБ) с 1% глюкозы и 1% глицерина. При этом используют 2 флакона со средой. Во втором флаконе создают условия для роста B. abortus. Этот вид бруцелл требует СО2 для роста. Поэтому флакон с бульоном после посева в него исследуемого материала закрывают тлеющей ватно-марлевой пробкой.
Посевы размещают в термостате при температуре 37°С и культивируют в течение нескольких дней.
Далее делают пересев на плотные питательные среды: печеночный агар, сывороточно-декстрозный или кровяной агар (КА).
Питательные среды: сывороточно-декстрозный агар, агар из картофельного настоя + сыворотка, КА, печеночные среды. Используют куриные эмбрионы. рH 6,8–7,2; t°36–38°C. Бруцеллы растут очень медленно, особенно в первых генерациях. 1–3 недели Br. melitensis и Br. suis растут в аэробных условиях; Br. abortus требует СО2 до 10%. На агаре бесцветные перламутровые колонии при длительном выращивании приобретают бурую окраску. В бульоне равномерное помутнение с последующим выпадением крошковидного осадка. На плотных питательных средах колонии бруцелл обладают изменчивостью из S- в R-формы, карликовые L-формы. Бруцеллы ферментируют арабинозу, декстрозу, галактозу. Образуют сероводород.
На этих средах бруцеллы растут в виде нежных бесцветных выпуклых круглых колоний диаметром от 1 до 5 мм (S-формы). Их сравнивают с капельками росы. Иногда появляются R-формы колоний. В мазках из типичных колоний видны мелкие грамотрицательные бактерии овоидной или палочковидной формы.
Подозрительные колонии пересевают на скошенный печеночный агар и после выделения чистой культуры микробов идентифицируют их. При этом учитывают морфологические, тинкториальные, культуральные свойства, потребность в СО2 для роста, способность расти на средах в присутствии фуксина, тионина, выделять H2S, образовывать уреазу, фосфатазу, каталазу; чувствительность к специфическому поливалентному бактериофагу; агглютинацию моноспецифическими бруцеллезными сыворотками (табл. 3.1).
Таблица 3.1
Основные свойства видов и биоваров бруцелл
источник заимствования – ресурсы сети Интернет
Вид |
Биовар |
Потребность в СО2 |
Продукция H2 S |
Рост на средах с красителями* |
Агглютинация моноспецифическими сыворотками |
Чувствительность к фагу «Т6» в рабочем разведении |
Основной хозяин |
|||||
Тионин |
Основной фуксин |
|||||||||||
а |
б |
в |
б |
в |
А |
М |
||||||
B. melitensis |
1
2
3 |
|
|
|
|
|
|
|
+
+ |
|
|
Овцы, козы |
B. abortus |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 |
+/– + +/– +/– – – – – –/+ |
+ + + + – +/– –/+ – + |
– |
– – + – + + + + + |
– – + – + + + + + |
+ – + + + + + + + |
+ – + + + + + + + |
+ + + – – + + – – |
– – – + + – + + + |
+ + + + + + + + + |
Крупный рогатый скот |
B. suis |
1
2
3
4 |
–
–
–
– |
++
–
–
– |
+
–
+
+ |
+
+
+
+ |
+
+
+
+ |
–
–
+
+ |
–
–
+
+ |
+
+
+
+ |
–
–
–
+ |
–
–
–
– |
Свиньи, зайцы, северные олени |
*Концентрация красителей: а 1:25000; б 1:50000; в 1:100000
Серологический
Определяют титр антител к бруцеллам в сыворотке крови обследуемого в реакциях Райта и Хеддльсона. В качестве антигена используют бруцеллезный единый диагностикум. Этот диагностикум представляет собой гомогенную суспензию инактивированных бруцелл, окрашенную в синий цвет. При постановке реакции агглютинации Райта из сыворотки больного готовят разведения 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 в физиологическом растворе, в который предварительно добавляют 0,5% фенола в объеме 0,5 мл, а затем добавляют по 0,5 мл бруцеллезного единого диагностикума в разведении 1:10. Реакция считается положительной при титре 1:100–1:200, а при титре 1:800 и выше – резко положительной.
Реакцию Хеддльсона ставят на хорошо обезжиренном стекле, расчерченном на 6 квадратов. На первом квадрате записывают номер сыворотки, а на второй, третий, четвертый и пятый квадрат наносят исследуемую сыворотку в объемах 0,04 мл; 0,02 мл; 0,01 мл; 0,02 мл, шестой квадрат – контроль сыворотки. В контроль сыворотки добавляют 0,03 мл физиологического раствора, в другие капли сыворотки – 0,03 мл неразбавленного бруцеллезного единого диагностикума. На шестом квадрате – 0,03 мл антигена + 0,03 мл физиологического раствора – (контроль антигена). Учет реакции проводят в течение 8 минут. Негативная реакция – агглютинат отсутствует во всех объемах сыворотки. Сомнительная реакция – агглютинат только в объеме 0,04 мл. Положительная реакция – агглютинат в объемах 0,02–0,01 мл. Резко положительная реакция – агглютинат во всех объемах сыворотки. Реакцию применяют при массовом обследовании людей. Положительный результат позволяет отобрать лиц с подозрением на бруцеллез для дальнейшего углубленного обследования.
Биологический
Применяют для выделения бруцелл в чистой культуре из материалов, загрязненных посторонними микроорганизмами. Для этого используют морских свинок и белых мышей. Исследуемый материал вводят подкожно или внутрибрюшинно.
Аллергологический
Проба Бюрне. В среднюю часть внутренней поверхности предплечья внутрикожно вводят 0,1 мл бруцеллина (фильтрат из 3–4-недельных бульонных культур бруцелл трех типов). Положительная реакция характеризуется образованием через 24 часа патологического инфильтрата размером 4×6 см и гиперемией. Эта реакция специфическая. Она проявляется через 1–2 недели после начала заболевания и сохраняется годами.
Принципы профилактики
С целью профилактики бруцеллеза применяют накожную сухую живую бруцеллезную вакцину, для лечения – убитую вакцину, с целью аллергодиагностики – аллерген бруцеллин.
Бруцеллезная вакцина, предложенная П.Ф. Здродовским, П.А. Вершиловой, представляет собой взвесь живой культуры вакцинного штамма Br. abortus 19-BA. Вакцину применяют для вакцинации и ревакцинации людей против бруцеллеза. Вакцинацию проводят накожно однократно.
Бруцеллезная лечебная вакцина представляет собой взвесь убитых нагреванием бруцелл овечьего и коровьего видов. Ее используют для лечения больных бруцеллезом в острой, подострой и хронической формах заболевания.
Бруцеллин – это фильтрат 3-недельной убитой нагреванием бульонной культуры бруцелл из штаммов овечьего, коровьего и свиного видов. Его используют для постановки внутрикожной пробы Бюрне. Реакция положительна с конца первого месяца заболевания. Бруцеллин вводят в дозе 0,1 мл строго внутрикожно в среднюю часть ладонной поверхности предплечья.
Принципы лечения
При наличии бактериемии назначают антибиотики широкого спектра действия.
При хроническом бруцеллезе применяют иммунотерапию убитой лечебной бруцеллезной вакциной или бруцеллином.
При острых и рецидивирующих формах – иммуноглобулин.