6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

тем помещают на сетку, после того как раствор стечет, укладывают на вскрывочные доски, группируя по точкам добычи и видам.

При эпидемиологическом обследовании природного очага чумы тактика лабораторного подхода зависит от эпидемиологической ситуации в данном очаге:

-ситуация до обнаружения эпизоотии на данной территории;

-ситуация после выделения первой культуры возбудителя чумы.

До обнаружения эпизоотии у всех зверьков исследуют только печень и селезенку. Вскрытие проводят без отсепарирования кожи, откидывая кожно-мышечный лоскут на мордочку животного. Суспензии готовят из органов зверьков одного вида, добытых в одной точке обследования.

Для одной суспензии объединяют органы не более чем от 10 мелких зверьков, от 5 сравнительно крупных (сурки, хори и т.д.). Кусочки органов тщательно растирают в ступке со стерильным песком, затем добавляют небольшое количество 0,9%-ного раствора хлористого натрия рН 7,2 (не более 2 мл). Полученную суспензию используют для посева на плотные питательные среды, нанося каплю суспензии у края чашки и рассевая ее по всей поверхности петлей частыми штрихами. Этой же суспензией заражают биопробное животное. После обеззараживания суспензия используется для поиска антигена.

При выделении первой культуры от животных на исследование целесообразно забирать кроме печени и селезенки еще кровь и проводить дублирование посевов –отпечатками органов и посевами суспензий. При посеве отпечатками на одну чашку агара может быть посеян материал от 2 животных.

357

При обнаружении характерных для чумы патологоанатомических изменений у животных, кроме печени, селезенки, крови, обязательно исследуют легкие, лимфоузлы (паховые, аксилярные, глоточные, паратрахеальные, забрюшинные) и участки измененных органов и тканей. Из всех органов делают мазки-отпечатки и исследуют их. Органы от каждого животного сеют отпечатками на пластинки агара, затем собирают в ступку со стерильным песком и готовят суспензию, которую засевают на агар. Этой же суспензией заражают индивидуальную биопробу. Остальной материал после обеззараживания используют для серологического исследования, направленного на поиск специфических для чумы антигенов (РПГА-РНАт), а также для выявления ДНК возбудителя чумы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Суспензии сгустков крови сердца и крупных сосудов после инактивации исследуют серологически на наличие специфических антител (РПГА-РНАг).

Трупы животных, найденных в поле, исследуют так же, как зверьков с патологоанатомическими изменениями, но, кроме этого, уних обязательно исследуют костный или головной мозг (посевом на отдельную чашку и постановкой индивидуальной биопробы). Для посевов используют селективные питательные среды с ингибиторами роста посторонней флоры.

При исследовании полевого материала в качестве биопробных животных могут быть использованы белые мыши и морские свинки. Заражают биопробных животных подкожно в паховую область. В случае работы с сильно загрязненным материалом (загнившие трупы, субстраты нор, помет) применяют накожный метод заражения.

Павших биопробных животных исследуют, проводя вскрытие по полной схеме (отсепаровка кожи, ос-

358

мотр и посев лимфоузлов, посев всех органов, крови, серологическое исследование на наличие антигена). От павшей биопробы обязательно ставят пассажи до выяснения причины гибели. После обеззараживания суспензия органов павшей биопробы может быть исследована в ПЦР.

Биопробных животных, выживших после заражения, забивают через 6 суток также с полным бактериологическим исследованием без пассажа. При исследовании материала из сочетанных природных очагов чумы и туляремии биопробных животных забивают на 8-9-е сутки. Чашки с посевами инкубируют при 28°С. Просмотр осуществляют через 24-48 ч и далее ежедневно до 5 суток от момента посева.

Выделенную культуру идентифицируют по следующим признакам:

•морфология роста на питательном агаре и бульоне;

•морфология клетки, характер окраски по Граму;

•лизис диагностическими бактериофагами Л-413С, Покровской;

•ферментация мочевины, рамнозы, глицерина;

•характерный рост на среде ЦДС (отсутствие способности к ферментации мочевины и лактозы);

•чувствительность к антибиотикам дискодиффузионным методом (при выделении первой культуры).

Окончательную идентификацию и изучение культуры чумного микроба проводят в стационарной лаборатории противочумной станции или института, имеющей разрешение на проведение экспериментальной работы с микроорганизмами I группы патогенности по следующим признакам:

•наличие F1;

•биохимическая активность (пестрый ряд), подвижность;

•вирулентность для лабораторных животных;

359

•плазмидный состав (pCad, pPst, pFra);

•способность к нитрификации и денитрификации;

•пестицин-фибринолизин-плазмокоагулазная активность;

•чувствительность к пестицину 1;

•питательная потребность (при необходимости). Серологический метод исследования полевого мате-

риала. Все серологические исследования ведутся только с обеззараженным материалом и оттитрованными (не реже 1 раза в 2 недели) ингредиентами. Формалин используют нейтральной рН и с проверенной антибактериальной активностью.

Для поиска антител исследуют сыворотки, смывы из сердца и крупных сосудов или высушенные на фильтровальных бумажках образцы крови и сыворотки животных. Поиск антител осуществляют у зверьков, относительно резистентных к чумному микробу (малый, длиннохвостый, горный, даурский суслики, полуденная песчанка с левого берега Волги, даурская пищуха, мелкие куньи и др.). Для обнаружения антител используют РПГА с антигенным диагностикумом, а также РНАг с иммуноглобулиновым диагностикумом. При массовых исследованиях реакции ставят в два этапа: вначале каждая из реакций в двух лунках и только при положительных результатах ставят развернутые реакции для определения их титра. Система однонаправленных реакций весьма информативна, т. к. по соотношению титров двух реакций (превышение титра РНАг) можно судить о давности контакта зверька с микробом, а при достаточно большом количестве исследований – о фазе эпизоотии на данном участке территории.

При сомнительных результатах реакции повторяют после адсорбции исследуемого материала 50%-ной взве-

360

сью формалинизированных и несенсибилизированных эритроцитов, параллельно ставят идентичные реакции с гетерологичными диагностикумами (туляремийным, бруцеллезным, холерным и др.).

Для поиска антигена готовят суспензии из исследуемого материала (приложение) и ставят серологические реакции: РПГА и РТПГА с иммуноглобулиновым диагностикумом и РНАт с антигенным диагностикумом. С целью подтверждения специфичности результатов следует тот же материал использовать в системе серологических реакций (РПГА-РНАт) с гетерологичными диагностикумами (туляремийным, бруцеллезным, холерным и др.).

Тактика применения иммуноферментного анализа для поиска антигена FI и антител к нему такая же, как при использовании иммуносуспензионных методов.

ПЦР используется при углубленном эпизоотологическом обследовании территории (преимущественно в пунктах долговременного наблюдения). Исследованию подлежат суспензии органов носителей чумы с характерными патологоанатомическими изменениями, трупов павших зверьков, трупов верблюдов, а также, при необходимости, суспензии эктопаразитов, субстраты гнезд грызунов, погадки и остатки пищи хищныхптиц,пробыпочвыидр.Дляпроведениягенодиагностического анализа применяют «Тест-систему для выявления Y. pestis методом полимеразной цепной реакции», производства РосНИПЧИ «Микроб» (рекомендована комитетом МИБП МЗ РФ для практического использования).

Метод ДНК-зондов может быть использован как для характеристики плазмидного профиля штаммов при идентификации выделенных культур, так и при исследовании суспензии органов животного. Для повыше-

361

ния чувствительности метода возможно подращивание образцов путем помещения нейлонового фильтра с нанесенным материалом на поверхность агара Хоттингера на 16-24 ч при 28°С. После нанесения исследуемого материала на фильтр его инактивируют парами хлороформа. Для этого на крышку чашки Петри, в которую помещен фильтр с исследуемым материалом, наносят 0,5 мл хлороформа, выдерживают в таком виде (крышка снизу) в эксикаторе в течение 30 мин, после чего фильтр считается обеззараженным и может пересылаться для дальнейшего исследования в стационарную лабораторию противочумной станции или института.

Лабораторная диагностика чумы у переносчиков

Материал для исследования: блохи, счесанные с грызунов и собранные из гнездовой камеры норы, из ходов и из устьев нор и других мест обитания, включая жилища человека и надворные постройки. По эпидпоказаниям блох счесывают с домашних животных (кошек,собак);клещи,счесанныесгрызунов(присосавшихся снимают пинцетом), собранные из нор, с поверхности земли вокруг нор, а также снятые с верблюдов, других сельскохозяйственных животных и различных объектов в соответствии с конкретными задачами обследования. Эктопаразиты доставляются в лабораторию в стерильных пробирках под ватно-марлевыми пробками живыми или в консервирующей жидкости: 2%-ный раствор хлористого натрия с генцианвиолетом 1:200 000 и сразу по поступлению подлежат исследованию. Блох исследуют индивидуально или групповым методом. Индивидуальному исследованию подлежат все эктопаразиты, собранные с трупов животных или животных с патологоанатомическими изменениями, похожими на чуму, а также с целью определения про-

362

цента зараженности блох.

Групповым методом исследуют блох, собранных с каждого грызуна или одной норы. В один посев, как правило, можно объединять не более 20-50 насекомых. Допускается объединять в одну пробу блох с грызунов из одного участка или из близлежащих гнезд.

Блох перед исследованием усыпляют эфиром и без предварительного промывания ссыпают в стерильную ступку, куда вносят 0,5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия рН 7,2 или чумной антифаговой сыворотки. После растирания делают посев на агаровые пластинки.

Иксодовых клещей в один посев берут не более: пивших самок - 3, голодных – до 30, пивших нимф - до 15, голодных – до 50, пивших личинок - до 30 экземпляров.

Перед исследованием клещей промывают в 50-70°- ном спирте, затем в 2-3 порциях 0,9%-ного раствора хлористого натрия рН 7,2. При растирании напившихся клещей ступку прикрывают крышкой от чашки Петри, пивших самок перед растиранием разрезают ножницами. Полученную суспензию высевают на питательный агар. В отдельных случаях эту суспензию используют для заражения биопробных животных.

Занятие 14. Исследование мокроты и крови больного.

•Просмотр посевов мокроты и крови больного на пластинчатом агаре под малым увеличением микроскопа, изучение начального роста колоний.

•Пересев крови с ПБ на чашку ПА.

•Учет ориентировочной пробы с бактериофагом.

•Учет чувствительности к антибиотикам ускоренным дискодиффузионным методом.

363

Исследование блох.

•Приготовление суспензии из блох.

•Посев суспензии на ПА с генцианвиолетом.

•Извлечение желудка из хлороформированной блохи с помощью препаровальных игл на предметном стекле с лункой под малым увеличением микроскопа.

•Посев извлеченного желудка на чашку ПА с генцианвиолетом.

•Постановка биопробы на белых мышах с желтком.

Занятие 15.

Исследование мокроты больного. Выделение чистой культуры.

•Просмотр роста на среде с генцианвиолетом, отбор похожих на рост возбудителя чумы колоний, приготовление мазков, окрашивание по Граму.

•Пересев отобранных колоний на сектора чашки ПА и ПА с генцианвиолетом, в ПБ.

•Исследование крови больного. Выделение и идентификация культуры.

•Просмотр посевов на чашках ПА, приготовление мазков, окрашивание по Граму.

•Пересв культуры на скошенный ПА и в бульон.

•Постановка пробы с бактериофагом Л-413С (приложение).

•Посев на среды Гисса с глюкозой, лактозой, рамнозой, арабинозой, глицерином.

•Посев на ЦДС (приложение).

•Посев в 0,3% ПА.

•Определение чувствительности к антибиотикам стандартизированным дискодиффузионным методом.

364

Занятие 16.

Исследование мокроты больного. Идентификация выделенной культуры.

•Просмотр роста культуры на секторах чашкиПА и в ПБ.

•Отбор одного из секторов, проверка культуры на чистоту роста мазком с окраской по Граму.

•Посев отобранной культуры на среды Гисса с глюкозой, лактозой, арабинозой, рамнозой, глицерином, ЦДС, в бульон для определения нитритов, в 0,3% ПА.

•Постановка пробы на фибринолитическую и коагулазную активность.

•Посев культуры бляшкой на 1,5% питательный агар с генцианвиолетом для определения пестициногенной активности.

•Определение чувствительностиь выделенной культуры к антибиотикам стандартизированным дискодиффузионным методом.

•Постановка пробы с диагностическими чумными бактериофагами (Л-413С, Покровской).

•Окончание исследования крови больного.

•Учет результатов идентификации культуры.

•Регистрация чувствительности к антибиотикам.

•Заключение по анализу, заполнение паспорта, обез-

зараживание объектов с посевами.

Исследование блох на чуму. Выделение культуры.

•Просмотр посевов на чашках агара с генцианвиолетом.

•Отбор похожих на рост чумного микроба колоний.

•Пересев на сектора чашек ПА, ПА с генцианвиолетом и в бульон.

365

Занятие 17. Исследование грызунов.

Исследование трупа грызуна.

•Приготовление мазков-отпечатков из органов грызуна.

•Посев печени, селезенки, крови, легкого, измененных лимфоузлов на сектора чашек ПА и ПА с генцианвиолетом.

•Приготовление суспензии из органов и посев на ПА и ПА с генцианвиолетом. Обработка части суспензии формалином для поиска F1.

•Посев крови из сердца в бульон (если нет признаков загнивания).

•Взятие крови для серологического исследования на антитела против F1, используя фильтровальную бумагу, пропитанную мертиолятом натрия.

•Посев костного или головного мозга на ПА.

•Постановка биопробы на белых мышах из суспен-

зий органов и головного мозга.

Исследование отловленных грызунов с патологоанатомическими изменениями в органах.

•Посев печени, селезенки, крови, легкого, измененных лимфоузлов на сектора чашки ПА и ПА с генцианвиолетом.

•Приготовление суспензии из органов и посев на ПА

иПА с генцианвиолетом. Обработка части суспензии формалином для поиска F1.

•Посев крови из сердца в бульон.

•Взятие крови для серологического исследования на антитела против F1, используя фильтровальную бумагу, пропитанную мертиолятом натрия.

•Постановка биопробы на белых мышах.

Исследование отловленных грызунов без патологоа-

натомических изменений в органах групповым методом (до выделения первой культуры).

366