6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

Примечание:

«+» -наличие признака; «-» -отсутствие признака;

«±» - наличие признака не у всех штаммов; «+/-» -чув- ствительны к пестицину штаммов основного и алтайского подвидов и нечувствительны к пестицину штаммов собственного подвида.

327

Y. pestis-полиморфная овоидная грамотрицательная палочка, длиной 1-2 мкм, толщиной 0,3-0,7 мкм, с закругленными концами и утолщенной серединой.

В мазках с плотной питательной среды палочки могут быть удлиненными, нитевидными; описаны также фильтрующиеся формы. При затяжном заболевании в мазкахизбубонаиоргановбольноговозбудительчумы может принимать форму шаров различной величины

итеней. В мазках-отпечатках из тканей и органов, а также в мазках из бульонных культур окрашивается биполярно (более интенсивно на концах клетки). Биполярность ярче выявляется при окраске метиленовой синькой Леффлера.

Возбудитель чумы не имеет жгутиков и спор. Капсулу образует в организме теплокровных животных и людей, кровяном и сывороточном агаре при температуре 37°С.

Чумной микроб – облигатный паразит с факультативным анаэробным типом дыхания, относится к природным ауксотрофам. Помимо источника энергии нуждается в дополнительных факторах роста – аминокислотах

ивитаминах. Для роста при 28°С необходимы фенилаланин, валин, метионин, изолейцин и глицин или треонин; при 37°С - биотин, тиамин, глютаминовая кислота и пантотенат. Штаммы из разных очагов чумы, как правило, имеют неодинаковые потребности в факторах роста, что находит отражение в схеме внутривидовой таксономии чумного микроба.

Для культивирования возбудителя требуются питательныесредысглубокимрасщеплениембелка.Лучшимипо качеству являются среды, приготовленные из ферментативных гидролизатов кровяных сгустков (не требуют добавления стимуляторов и рост наблюдается при посеве 10-100микробныхклеток)иказеина,перевараХоттинге-

328

ра, кислотного гидролизата рыбокостной муки. Самые распространенные среды для изучения чумного микроба: бульон и агар Хоттингера, Мартена, казеиново-дрожжевой агар (питательный агар для выращивания чумного микроба, сухой), дезоксихолатноцитратный агар.

Оптимальные условия выращивания: температура 28-30°С и pH 7,0-7,2, но возбудитель способен расти на питательных средах в температурном диапазоне от 2 до 45°С и показателях pH среды от 5,8 до 8,0.

Чумной микроб на плотных питательных средах имеет характерную морфологию роста. При посеве бактериологической петлей через 24-48 часов инкубации представляет собой бурый «тяж» в начале штриха и отдельные шероховатые колонии в конце. Морфология колоний под микроскопом является одним из основных диагностических признаков возбудителя чумы. Через 12 ч инкубации появляются микроколонии в виде нежных прозрачных образований чаще треугольной или прямоугольной формы, напоминающих битое стекло (рис.23).

Рис.23. «битое стекло» (12-24 ч)

Через18-24чмикроколониисливаютсявплоскиепро- зрачные образования с фестончатыми краями - «кружевные платочки» (рис.24).

Рис.24. «кружевные платочки» (18-24 ч)

В дальнейшем (24-48ч) «кружевные платочки» пре-

329

вращаются в зрелые колонии. Типичные зрелые колонии имеют бурый зернистый центр с постепенно уплощающейся прозрачной периферической зоной с фестончатыми краями.

На скошенном агаре возбудитель чумы растет в виде сочного, серовато-белого налета, хорошо фиксированного на среде. На жидкой питательной среде (МПБ, бульон Хоттингера и др.) образует хлопьевидный или порошковидный, легко распадающийся при встряхивании осадок, в совершенно прозрачном бульоне и нежную пленку на поверхности.

Бактерии чумы растут в R-форме, которая является вирулентной. Однако они относительно легко могут диссоциировать под влиянием ряда факторов (например, под действием фага) и через О-форму пере - ходить в S-авирулентную форму.

Возбудитель чумы имеет признаки, характерные для представителей семейства Enterobacteriaceae. Он оксидазо-отрицателен и каталазо-положителен; проявляет выраженную ферментативную активность по отношению к различным моно-, ди-, трисахаридам и спиртам; расщепляет на 1-3 сутки глюкозу, маннозу, маннит, мальтозу, эскулин, до кислоты без газа; не ферментирует лактозу, сахарозу, сорбит, инозит, дульцит, мочевину. Отношение к глицерину, салицину, арабинозе, рамнозе и мелибиозе - вариабельное. Не образует индол, сероводород, ацетилметилкарбинол. Дает положительную реакцию с метиловым красным. Протеолитические свойства выражены слабо: не разжижает желатин и не свертывает молоко (табл. 23).

330

Таблица 23 Основные ферментативные свойства возбудителей чумы

Тест

Примечание:

«+» - расщепление; «-»-отсутствие расщепления;

«±» - возможны варианты расщепления.

Важным свойством чумного микроба является его способность к денитрификации, т.е. восстановлению нитратов в нитриты. Эта окислительно-восстанови- тельнаяреакцияслужитстойкойгенетическойметкой, используемой во всех схемах внутривидовой классификации штаммов чумного микроба.

Чумной микроб (кроме штаммов, выделенных от полевок на Закавказском нагорье), в отличие от псевдотуберкулезного микроба, синтезирует ферменты патогенности - фибринолизин и плазмокоагулазу. Фибринолизин обладает способностью локально растворять сгустки фибрина и фибриногена крови в очагах воспаления. Плазмокоагулаза обусловливает свертывае-мость плазмы крови кролика, морской свинки и человека. Фибринолизин-коагулазная системаобеспечиваетвозбудителючумывысокуюинвазивную способность и генерализацию чумной инфекции. Большинство штаммов чумного микроба продуцируют в окружающую среду антибиотикоподобное вещество (бактериоцин), который получил название

331

пестицин 1(Р1). Он представляет собой видоспецифический термолабильный мономерный белок. Р1 участвует в гидролизе муреинлипопротеина клеточной стенки чувствительных к нему клеток, превращая их в нежизнеспособные сферопласты. Он подавляет рост штаммов Y. Pseudotuberсulosis I серовара (по Талю) и некоторых штаммов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах чумы Закавказского нагорья, Горного Алтая, на Гиссарском хребте, в Таджикистане, и т.д., что связано с наличием в их составе 3,6-ди-деоксид- В-рибогексозы, которая выполняет роль рецептора для Р1. Способность к продукции пестицина 1, фибринолизина и плазмокоагулазы является видовым признаком штаммов Y. pestis и играет важную роль в таксономии и дифференциальной диагностике чумы. Исключение составляют штаммы кавказского подвида, которые выделяются от полевок в Закавказском нагорье и Горном Дагестане. Они не только не продуцируют Р1, но и проявляют к нему чувствительность. Пестицин-фибринолизин-плазмокоагулаза кодируются одной низкомолекулярной плазмидой - pPst. Эти признаки сцеплены друг с другом и потеря одного из них сопровождается потерей двух других.

В настоящее время методами иммунохимического анализа в чумном микробе обнаружено до 90 иммунохимически активных компонентов, среди которых многие являются общими с Y. pseudotuberсulosis, E. coli, Schigella и эритроцитами человека О-группы. И только некоторые из них, как капсульный антиген (фракция I, FI), являются специфическими для возбудителя чумы. FI-основой компонент, связанный с капсулой, представляет собой чистый белок. Наиболее интенсивно синтез FI происходит при 37°С выращивания in vitro и организме животных (in vivo). При более низких

332

температурах культивирования капсульный антиген у микроорганизма не обнаруживается. В организме членистоногих (блох) FI не выявляется. Фракция I является основным иммуногеном и обладает строгой специфичностью, хотя в природе описаны штаммы, не синтезирующие этот белок.

Геном возбудителя чумы состоит из хромосомы размером 4,65 т.п.н. и трех плазмид-пестиногенности (pPst), кальцийзависимости (рСаd), фракции I и «мышиного токсина» (pFra), имеющих молекулярные массы соответственно 6, 47 и 61-65 мегадальтон.

pPst кодирует продукцию пестицина I, устойчивость к нему, синтез фибринолизина и плазмокоагулазы. Наличие этой плазмиды повышает вирулентность возбудителя чумы в опытах при подкожном заражении морских свинок и белых мышей.

рСаd определяет характер роста клеток при 37°С в зависимости от наличия в среде ионов кальция, а также отвечает за синтез антигенов V, W и других поверхностных белков.

pFra ответственна за продукцию фракции I и синтез «мышиного» токсина.

Возбудитель чумы относится к группе полипатогенных бактерий с высокой инвазивностью, но с относительно невысокой токсичностью. К ферментам патогенности относятся гиалуронидаза, фибринолизин, коагулаза, нейраминидаза, каталаза и др. Характерными признаками вирулентных штаммов возбудителя чумы являются: наличие капсулы, V- W- и рН6-антигенов, способность синтезировать пурины, образование пигментированных колоний на среде с гемином, пестициногенность, неспособность расти на средах при 37°С в отсутствии ионов кальция.

Дифференциальная диагностика культуры чумного

333

микроба от большинства видов патогенных бактерий и банальной микрофлоры, как правило, особого труда не составляет. Если культуру чумного микроба невозможно дифференцировать от палочки Фридлендера, кишечной палочки, сальмонелл и других представителейкишечнойгруппыбактерийпримикроскопиимазков, так как они практически ничем не отличаются, то по морфологии колоний на агаре и характеру роста на жидких питательных средах это сделать, возможно. Исключением является возбудитель псевдотуберкулеза в R- и ORформах, который по морфологии микроба в мазках, а так же культуральным свойствам часто просто невозможно отличить от возбудителя чумы. В таблице 24 представлена дифференциальная диагностика.

Таблица 24 Дифференциация возбудителей чумы и псевдотубер-

кулеза

334

Примечание:

* - типичныевирулентные штаммы.

**- 17-25% штаммов Y. Pseudotuberculosis лизируют-

ся чумным фагом Покровской.

***- свежевыделенные штаммы чумного микроба могут фер ментировать мочевину.

****- способность синтезировать капсульный антиген (F1) отсутствует у штаммов возбудителя чумы, выделяемых во Вьетнаме (в том числе и от людей), а также – от грызунов в некоторых Среднеазиатских природных очагах чумы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ Занятие 1.

Биологические свойства Y.pestisи Y.pseudotuberculosis

• Изучение характера роста культуры на скошенном агаре.

• Изучение морфологии микробов в мазках, приготовленных из агаровой культуры, и в мазках-отпе- чатках органов грызунов, павших от чумы. Окрашивание мазков по Граму и синькой Леффлера. Постановка пробы с 3% КОН.

• Посев каждой культуры на 3 чашки питательного агара (ПА), 2 чашки агара с генцианвиолетом, в пробирки с 0,3% питательным агаром, средами Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, глицерином, рамнозой, арабинозой, маннитом, мальтозой, со средой Кристенсена, цветной дифференциальной средой (ЦДС), в питательный бульон (ПБ), ПБ с KN03, в пробирки со скошенным питательным агаром.

•Определение пестициногенной активности (приложение).

335

•Посев культуры возбудителя чумы и возбудителя псевдотуберкулезаначашку1,5%питательногоагара с генцианвиолетом бляшками диаметром 0,5-1,0.

Примечания:

-посев на ПА поместить при 28°С, 37°С и при комнатной температуре;

-посевы на агаре с генцианвиолетом - при 28°С и при комнатной температуре;

-посев на 0,3% ПА - в шкаф при комнатной температуре;

Занятие 2.

Биологические свойства Y.pestisи Y.pseudotuberculosis

•Изучение морфологию формирующихся колоний на ПА, ПА с генцианвиолетом.

•Изучение морфологии роста культур в бульоне.

•Приготовление мазков из агаровой и бульонной культур, окрашивание по Граму и синькой Леффлера.

•Определение подвижности на 0,3% ПА.

•Изучение ферментации углеводов и спиртов на средах Гисса, уреазной активности на среде Кристенсена и ЦДС (приложение).

•Изучение фаголизабельности.

•Постановка пробы на чувствительность к бактериофагам Л-413С, Покровской, псевдотуберкулезному методом «стерильного пятна».

•Постановка пробы на чувствительность к бактериофагам Л-413С, Покровской, псевдотуберкулезному двухслойным методом (приложение).

•Постановка пробы на чувствительность к бактериофагу Покровской методом дифференциального рабочего титра (приложение).

•Постановка пробы на чувствительность к бактериофагу Л-413С ускоренным методом.

336