6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

натрия хлорида и растирают. Затем с помощью пипетки через ватный тампон в отдельную микропробирку отбирают надосадочную жидкость, из которой проводят выделение ДНК.

Пробы клещей, объединенных по 5–50 шт., комаров, объединенных по 50–100 шт. (в зависимости от вида, точки сбора, упитанности и т.д.), растирают в охлажденной стерильной фарфоровой ступке с 0,5–1,0 г охлажденного стерильного стеклянного порошка, добавляют 1–2 мл охлажденного 0,9% раствора натрия хлорида. Затем переносят по 1,0 мл жидкой фазы в пластиковые микропробирки объемом 1,5 мл. Подготовленныеобразцыцентрифугируютпри12000об/минв течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для выделения ДНК, для чего отбирают 0,1 мл образца.

Отобранные навески соломы и мякины измельчают при помощи ножниц и пинцета на листе бумаги, затем помещают в банки. К исследуемому материалу добавляют 0,9% раствор натрия хлорида 1:10, тщательно перемешивают в течение 15 мин, отстаивают в течение 10 мин для оседания крупных частиц. Надосадочную жидкость дробно центрифугируют: первоначально в течение 2–3 мин при 5000 об/мин, затем супернатант центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. Осадок суспендируют в 0,2–0,5 мл дистиллированной воды. Подготовку гнезд грызунов осуществляют аналогичным образом.

Пробы погадок птиц и помета хищных млекопитающих суспендируют в физиологическом растворе из расчета 1:9 (1 часть пробы + 9 частей физиологичесого раствора). Для исследования отбирают 1 мл суспензии и переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Пробирки центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин. Отдельным наконечником с

297

аэрозольным барьером из каждой пробирки отбирают надосадочную жидкость и переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют. Осадок ресуспендируют в 0,1 мл 0,9% раствора натрия хлорида и используют для исследования.

Пробыводыоткрытыхводоемовобъемом1,0лдробно центрифугируют.Первоначальновтечение15минпри 10000–12000 об/мин. Полученный осадок ресуспендируют в 0,5 мл физиологического раствора, помещают в микроцен трифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 2000–5000 об/мин в течение 1 мин. Надосадочную жидкость отбирают наконечником с аэрозольным барьером в микропробирку объемом 1,5 мл. Для выделения ДНК используют 0,1–0,2 мл надосадочной фракции.

Для проведения амплификации готовят необходимое количество микропробирок V-0,6 мл, соответствующее числу проб, а также две микропробирки для положительного и отрицательного контролей. Реакционную смесь готовят в отдельной пробирке из рассчёта на одну пробу: Н2О – 7,0 мкл, 10ХБ – 2,5 мкл, дНТФ

– 2,5 мкл, МgCl2 – 1 мкл, праймеров FT23s1 и FT23a1 –

по 1 мкл каждого, фермента Taq-полимеразы – 0,2 мкл. Во все пробирки вносят по 15 мкл реакционной смеси и добавляют 30 мкл (1 капля) минерального масла. Все манипуляции осуществляют при 4–5оС.

Всоответствующиепробиркидляпроведенияамплификации, используя одноразовые наконечники, вносят под масло по 10 мкл подготовленных проб. В пробирку, помеченную как положительный контроль, вносят 2 мкл контрольной ДНК (1 нг/мкл) и 8 мкл Н2О; в отрицательный контроль – 10 мкл Н2О. Все подготовлен-

298

ные микропробирки центрифугируют 20 сек при 2000 об/мин и помещают в амплификатор. Проводят ПЦР в следующем температурном режиме: денатурация при 94оС в течение 3 мин; затем 35 циклов: 94оС – 40 сек, 53оС – 40 сек, 72оС – 40 сек, в заключение проводят дополнительный цикл при 72оС в течение 5 мин.

Продукты ПЦР анализируют методом гель-электро- форезав1,5%агарозе,которуюготовятнаТАЕ-буфере с бромистым этидием (состав ТАЕ-буфера: трис-НСl

– 4,84 г; ледяная уксусная кислота – 1,2 мл; раствор ЭДТА в концентрации 0,5 М; бромистый этидий – до конечной концентрации 0,5 мкг/мл, общий объём доводят дистиллированной водой до 1 литра, рН 8,0).

К 10–20 мкл ПЦР-продукта добавляют 1–2 мкл 10-кратного буферного раствора, содержащего: бромфеноловый синий – 0,25%, фиколл – 25% в дистиллированной воде. Подготовленные смеси вносят в лунки агарозного геля.

Окрашенный бромистым этидием гель просматривают под ультрафиолетовым излучением, для чего используют трансиллюминатор с максимальной длиной волны 254 нм. Анализируемые фрагменты проявляются в виде светящихся розово-красных полос.

При оценке результатов в отрицательном контроле полосы должны отсутствовать, в положительном контроле выявляется полоса фрагмента размером 548 н.п.,

ванализируемых пробах отсутствие полосы строго на уровне положительного контроля свидетельствует об отрицательном ответе, а наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю – свидетельствует о наличии

впробе ДНК F. tularensis.

299

9. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

9.1. Биологические свойства возбудителя сибирской язвы

Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием человека и животных (домашних и диких). Основным источником инфекции при сибирской язве являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудителя с мочой, испражнениями и слюной в почву, инфицируя ее, поэтому почва, особенно богатая органическими веществами, становится дополнительным резервуаром возбудителя. Заражение животных происходит главным образом элементарным путем (через корм и питьевую воду, зараженные спорами), реже – трансмиссивным – через укусы кровососущих насекомых и воздушным путем.

Заражение человека сибирской язвой происходит при непосредственном контакте с трупами погибших животных, при разделке туш вынужденно убитых животных, при уходе за больными животными, при употреблении мяса или мясных продуктов, полученных от больных животных, при контакте с шерстью, шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем или его спорами.

Возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis относится к семейству Bacillaceae, роду Bacillus. Это крупная палочка длиной 5-8, иногда до 10 мкм, диаметром 1,0–1,5 мкм. Концы у живых палочек слегка закруглены, у убитых они как бы обрублены и слегка вогнуты. Палочки в мазках располагаются цепочками напоминая бамбуковую трость. Сибиреязвенная палочка хорошо красится всеми анилиновыми красителями, грамположительна. Жгутиков не имеет, образует споры, но только вне организма человека или животного

300

при наличии кислорода и определенной влажности. Оптимум для спорообразования 30-35 ºС (ниже 12ºС и выше 43ºС спорообразования не происходит). Споры располагаются центрально, их диаметр не превышает диаметра бактериальной клетки. Образование спор происходит в тех случаях, когда бактерии испытывают дефицит источников энергии. Поскольку в крови и тканях источники питания бактерий имеются, спорообразования в организме не происходит. Возбудитель сибирской язвы образует капсулу (рис.21), но только в организме животного и человека или на специальных питательных средах. Капсулообразование патогенных бактерий – защитный механизм.

Рис.21. Каспула возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis

Возбудитель сибирской язвы – аэроб или факультативный анаэроб. Температурный оптимум для роста 37 – 38ºС, рН среды 7,2 – 7,6. К питательным средам не требователен. На плотных средах образует характерные крупные матовые шероховатые колонии R-формы. Структура колоний, благодаря цепочечному расположению палочек, которые образуют нити, отходящие от центра, имеют сходство с локонами или львиной гривой (рис.22).

301

фактор (ОФ), протективный антиген (ПА) и летальный фактор (ЛФ). Установлено, что ОФ является ферментом - аденилатциклазой (цАТФ пирофосфатлиаза), который в неактивной форме продуцируется бактериальной клеткой и способствует повышению уровня цАМФ более чем в 200 раз. Активация аденилатциклазы в клетках макроорганизма происходит под воздействием Са-связывающего белка - кальмодуллина. Роль ПА заключается в создании рецепторной системы, через которую проникают ОФ и ЛФ. Кроме того, ПА способствует выработке в организме восприимчивого животного и человека специфических иммуноглобулинов, т.е. участвует в формировании антитоксического иммунитета. ЛФ проявляет цитотоксический эффект и вызывает отек легких.

Генетические детерминанты факторов патогенности сибиреязвенного микроба подробно изучены в результате клонирования генов отечного, протективного, летального компонентов токсина и капсулы, определения их нуклеотидных последовательностей, создания моделей возможных механизмов их регуляции. Наиболее распространенными подходами к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба являются определение плазмидного профиля штаммов, гибридизационный и ПЦР-анализ ДНК, которые в преимущественном большинстве случаев позволяют установитьразличиямеждуполностьювирулентными штаммами, несущими гены факторов патогенности и штаммами со сниженной вирулентностью, частично или полностью утратившими детерминанты факторов патогенности.

Кроме возбудителя сибирской язвы, токсинобразующей способностью обладает B. сereus, который продуцирует растворимый диаррогенно-летальный токсин,

303

вызывающий гибель мышей, крыс, грызунов, кроликов в течение 5-30 минут, у людей вызывает пищевую токсикоинфекцию, кератит, эндофтальмит, панофтальмит,эндокардит,менингит,остеомиелитипневмонию. Существует ряд отличительных признаков, позволяющих дифференцировать B. anthracis от близкородственных микроорганизмов: капсулообразование, лизис культуры под действием специфических сибиреязвенных бактериофагов, положительная проба с пенициллином (тест «жемчужное ожерелье»), специфическое свечение при исследовании люминесцент- но-серологическим методом, отсутствие фосфатазной и лецитиназной активности, роста в условиях культивирования при температуре 45ºС и др.

Дифференциальные признаки B. anthracis и B. сereus (типовой штамм 504 Т) приведены в таблице 19. Наличие 3 положительных тестов, в числе которых один из признаков патогенности, дает возможность отнести культуру к возбудителю сибирской язвы.

Таблица 19 Дифференциальные признаки B. anthracis и B. cereus

304

Примечание:

+ - положительный признак

– - отрицательный признак

± - в редких случаях, в поздние сроки (3-4 сут выращивания)

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ Занятие 1.

Изучение биологических свойств B.anthracisи B.сereus

•Изучение характера роста культур на скошенном мясопептонном агаре.

•Изучение морфологии микробов в мазках, окрашенных по Граму.

•Посев 24-часовых агаровых культур в мясопептонный бульон, 0,3% полужидкий агар, желатин, жидкую среду с желтком, на одну из капсулообразующих сред (скошенный молочно-солевой агар, среду ГКИ, скошенную среду Леффлера), на 2 чашки МПА, чашку МПА с желтком, чашку МПА с фенолфталеинфосфатом натрия и чашку 5% кровяного агара.

Примечания:

-посевы в желатине оставить при комнатной температуре;

-посев на капсулообразующей среде поместить в СО2- инкубатор и выращивать при 37 ºС в течение 24 ч;

-остальные посевы поместить при 37 ºС.

305

Занятие 2.

Изучение биологических свойств B.anthracisи B.сereus

• Изучение суточного роста:

а) просмотр колоний на МПА, в том числе морфологии колоний под микроскопом; б) изучение характера роста в МПБ.

•Изучение морфологии микроба в мазках, окрашенных по Граму, приготовленных с МПА и МПБ.

•Изучени подвижности в 0,3% ПЖА.

•Изучение гемолитической активности на 5% кровяном агаре.

•Изучение лецитиназной активности на:

а) жидкой среде с желтком, б) на агаре с желтком.

•Изучение протеолитической активности и характера роста в желатине.

•Изучение фосфатазной активности на МПА с ФФФ.

Наличие или отсутствие фосфатазной активности определяют на питательной среде с фенолфталеинфосфатом натрия, на которую штрихами засевают суточную агаровую культуру для получения изолированных колоний. Через 18-20 ч инкубации при 37 оС на крышку чашки Петри вносят 1-2 мл 25%-ного водного раствора аммиака. Чашку (крышкой вниз) выдерживают в течение 1 мин при 20±2оС, после чего визуально проводят учет теста (крышку при этом заменяют). Большинство сибиреязвенных штаммов не способны вырабатывать фосфатазу и, следовательно, разлагать фенолфталеинфосфат натрия. Спорообразующие сапрофиты разлагают фенолфталеинфосфат натрия с образованием индикатора фенолфталеина. Выросшие на питательной среде колонии B. anthracis после добавления аммиака, имеющего щелочную реакцию, остают-

306