6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

ции и др.

Экспрессные и ускоренные методы поиска антигена (РА, РHГА, РТHГА, реакции кольцепреципитации, МФА, ИФА) в исследуемом материале или антител к нему (РНАт, РА, РНГА, РТНГА, кровяно-капельная реакция, МФА, ИФА), а также обнаружение специфической ДНК возбудителя (ПЦР) позволяют получить результат в течение 2–5 ч.

При использовании экспрессных и ускоренных методов диагностики получают лишь предварительный результат, который должен быть подтвержден выделением чистой культуры возбудителя туляремии.

Современные методы исследования позволяют быстро и в определенной степени надежно поставить диагноз туляремии у человека и осуществить выявление возбудителя при обследовании территорий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ Занятие 3

Исследование грызунов:

•Вскрытие трупа грызуна:

-изучение патологоанатомических изменений внутренних органов;

-приготовление и исследование мазков-отпечатков из органов трупа грызуна, обработанных туляремийной люминесцирующей сывороткой;

-исследование в реакции кольцепреципитации суспензии органов (печень, селезенка) трупа грызуна;

-постановка из суспензии внутренних органов трупа грызуна индивидуальной биологической пробы (п/к заражением белых мышей);

•Вскрытие отловленного грызуна с патологоанатоми патологоанатомическимиизменениямивовнутренних органах, характерных для туляремии:

287

-изучение патологоанатомических изменений во внутренних органах грызуна;

-приготовление и просмотр мазков-отпечатков из органов грызуна, окрашенных по Романовскому-Гимза;

-посев на среды Мак-Коя и Анциферова лимфатического узла, крови, печени, селезенки;

-постановка из суспензии внутренних органов грызуна индивидуальной биологической пробы (п/к заражением белых мышей);

•Вскрытие отловленных грызунов без патологоанатомических изменений во внутренних органах:

-постановка из суспензии внутренних органов

грызунов биологической пробы (п/к заражением белых мышей).

Примечания:

-работа по заражению и вскрытию животных проводится курсантами в лаборатории экспериментальных животных;

-методыисследованиядикихгрызуновотрабатываются на заранее зараженных возбудителем туляремии белых мышах;

-павших биопробных животных вскрывают немедленно.

Исследование воды:

Вскрытие морской свинки, зараженной подкожно исследуемой водой:

-изучение патологоанатомических изменений во внутренних органах;

-приготовление и исследование мазков-отпечатков из внутренних органов морской свинки, обработанных туляремийной люминесцирующей сывороткой;

-посев печени, селезенки и пахового лимфатиче-

288

ского узла на среды Мак-Коя и Анциферова.

Примечание: морскую свинку курсанты заражают исследуемой водой заранее с учетом сроков гибели.

Занятие 4

Продолжение исследования грызунов. Выделение чистой культуры

•Просмотр посевов на средах Мак-Коя и Анциферова.

•Отбор подозрительных на туляремию культур, проверка её мазком, окрашенным по Граму, и в ОРА с туляремийной диагностической сывороткой 1:10, пересев на две пробирки каждой среды: Мак-Коя, Анциферова и скошенного МПА.

Продолжение исследования воды. Выделение чистой культуры

•Просмотр посевов на средах Мак-Коя и Анциферова.

•Отбор культуры, подозрительной на туляремию, проверка её мазком, окрашенным по Граму, и в ОРА с туляремийной диагностической сывороткой 1:10, пересев на две пробирки каждой среды: Мак-Коя, Анциферова и скошенного МПА.

Занятие 5

Продолжениеисследованиягрызунов.Идентификация культуры

•Просмотр посевов на средах Мак-Коя и Анциферова.

•Проверка на чистоту роста культуры мазком, окрашенным по Граму.

•Учет отсутствия роста на скошенном МПА.

•Постановка развернутой РА с выделенной культурой и туляремийной диагностической сывороткой 1:50.

•Посев выделенной культуры в пробирку со средой Мак-Коя, скошенного агара с глицерином, среду с

289

цитруллином.

•Определение чувствительности выделенной культуры к эритромицину.

Продолжение исследования воды. Идентификация культуры

•Просмотр посевов на средах Мак-Коя и Анциферова.

•Учет отсутствия роста на скошенном МПА.

•Проверка на чистоту роста культуры мазком, окрашенным по Граму.

•Постановка развернутой РА с выделенной культурой

итуляремийной диагностической сывороткой 1:50.

Примечание: окончательный учет результатов раз-

вернутой РА с туляремийной диагностической сывороткой через 18–24 ч.

Занятие 6 Окончание исследования грызунов и воды

•Просмотр посевов на среде Мак-Коя, скошенном агаре с глицерином, на среде с цитруллином.

•Проверка на чистоту роста культуры мазком, окрашенным по Граму.

•Регистрация чувствительности выделенной культуры к эритромицину.

•Заполннение паспорта на выделенные культуры.

Примечание: обеззараживание всех имеющихся посевов культур, выделенных от грызунов и из воды.

Серологические методы исследования на туляремию

Занятие 7 Серологическая диагностика туляремии у человека

•Постановка развернутой РА с сывороткой больного и туляремийным диагностикумом. Предваритель-

290

ный учет развернутой РА через 1 ч, окончательный

- через 18–24 ч.

•Постановка РНГА и РТНГА с сывороткой больного и туляремийнымэритроцитарнымантигеннымдиагностикумом. Учет результатов РНГА и РТНГА через 2 ч.

•Постановка кровяно-капельной РА с кровью больного и туляремийным диагностикумом

Реакциюприменяютдляэкспресснойсерологической диагностики туляремии у людей. В качестве антигена используют туляремийный диагностикум из микробов вакцинного штамма, убитых формалином (1 мл диагностикума содержит 25 млрд. м. кл.).

Вчашке Петри смешивают каплю исследуемой крови

икаплю дистиллированной воды для получения гемолиза эритроцитов. Затем к крови добавляют каплю диагностикума и перемешивают. Реакция агглютинации наступает немедленно, если в сыворотке крови больного содержатся антитела с диагностическим титром 1:100 и выше. Реакция бывает слабо выраженной и появляется в течение 5 мин, если в сыворотке крови больного содержатся антитела в более низком титре (1:50).

Исследование погадок хищных птиц

•Определение двух минимальных сывороточных единиц (2 СЕ) туляремийной диагностической сыворотки и постановка РНАт с материалом из погадок хищных птиц и туляремийным эритроцитарным антигенным диагностикумом.

Примечание: погадки хищных птиц курсанты получают предварительно подготовленными к исследованию.

Занятие 8 Окончание исследования погадок хищных птиц

Учет РНАт с материалом из погадок хищных птиц.

Аллергическиеметодыисследованиянатуляремию.

291

Исследование крови больного на туляремию в реакции лейкоцитолиза.

Эта реакция основана па учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического аллергена. Реакция лейкоцитолиза становится положительной к 3–4 дню с момента заболевания или вакцинации, В две лунки полистироловой пластины вносят по 50

мкл 5% раствора цитрата натрия. Кровь для исследования берут у людей из пальца в объеме 200 мкл с помощью микропипетки и вносят по 100 мкл в обе лунки, в первую (опытную) лунку вносят 100 мкл накожного тулярина, во вторую (контрольную) – 100 мкл физиологического раствора (рН 7,2). Содержимое лунок перемешивают стеклянной палочкой, пластину закрывают и помещают на 2 ч в термостат при 37°С. Через 2 ч содержимое опытной лунки перемешивают, микропипеткой набирают 20 мкл и переносят в лунку, содержащую 400 мкл 3% уксусной кислоты, подкрашенной метиленовой синькой до светло-голубого цвета. То же проделывают с кровью из контрольной лунки. Затем производят подсчет лейкоцитов в камере Горяева. Разрушенные клетки, а также собирающиеся в кучки лейкоциты не учитывают. Коэффициент лейкоцитолиза вычисляют по формуле:

К%= mkmk- mo x 100%

mk– количество лейкоцитов в контрольной лунке; mо – количество лейкоцитов в опытной лунке. Полученные результаты оценивают по шкале:

К– 15% и ниже – отрицательный или сомнительный;

К– от 16% до 20%–слабо положительный;

К– от 21% до 30%–положительный;

К– выше 30%–резко положительный.

292

Молекулярно-генетические методы исследования

Одним из основных генетических методов, используемых в настоящее время при исследовании на туляремию, является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Она даёт возможность с высокой надёжностью и в максимально сжатые сроки определить наличие возбудителя в пробах и начать своевременное проведение противоэпидемических мероприятий.

Сущность полимеразной цепной реакции состоит в избирательной амплификации определённых последовательностей, присутствующих в исследуемой ДНК. ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, соответствующего солевого буфера, дезоксинуклеозидтрифосфатов и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК-мишени. Реакцию проводят циклически, многократно (на протяжении 25-40 циклов), повторяя три этапа реакции в приборе, называемом термоциклером. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для её детекции с помощью электрофореза. В настоящее время для постановки ПЦР используют генодиагностические препараты, в основе которых лежит амплификация iglABCD, fopA или других видоспецифичных генов туляремийного микроба. К таким препаратам относятся экспериментальные серии «ГенТул» – тест системы для выявления ДНК F. tularensis методом ПЦР» (производства ФГУЗ Рос - НИПЧИ «Микроб») и «АмплиСенс F. tularensis –FRT»

– набора реагентов для выявления ДНК F. tularensis

293

в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва).

Не допустимо применение для генной диагностики туляремии праймеров, комплементарных гену 16 S рРНК и гену lpn, кодирующему синтез предшественника мембранного белка молекулярной массы 17 kD. Это связано с тем, что установлена высокая гомология этих генов у туляремийного микроба и F. philomiragia, Wolbachia persica и других эндосимбионтов клещей родов Amblyomma, Ornithodorus и Dermacentor.

К исследуемым образцам добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) с последующим прогреванием их при 56 оС в течение 30 мин. После обработки мертиолятом натрия 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объёмом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор на основе 6М гуанидинтиоизоцианата в объеме, указанном в инструкции к тест-системе, и инкубируют 15 мин при температуре 65 оС. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным.

Выделение ДНК, проведение ПЦР и учет результатов осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

Выявление фрагмента соответствующего по размеру фрагменту положительного контроля или наличие в пробе специфической флуоресценции по соответствующим каналам указывает на наличие в пробе ДНК туляремийного микроба.

Занятие 9 Исследование материала для выявления ДНК возбу-

294

дителя туляремии с использованием ПЦР

Занятие включает три последовательных этапа, которые выполняются в течение одного полного учебного дня. Для постановки реакции используется тест-система, разработанная в Российском научно-исследователь- ском противочумном институте «Микроб». Тестсистема предназначена для выявления возбудителя F. tularensis в клиническом материале и объектах внешней среды при помощи системы праймеров, комплементарных участку гена, кодирующего белок молекулярной массой 23 kD. Принцип реакции заключается

вмногократно повторяющихся циклах синтеза (амплификации) специфичной области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок

– праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК. Каждый цикл включает в себя три стадии с различными температурными режимами. На первой стадии при 94оС происходит разделение цепей ДНК, затем при 53оС – присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНКмишени, на третьей стадии при температуре 72оС – синтез новых цепей ДНК путём удлинения праймеров

внаправлении 5’– 3’ конца. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, ограниченного парой выбранных праймеров, что позволяет за 35 циклов наработать ДНК в количестве, достаточном для её детекции с помощью электрофореза. Материалом для исследования могут быть пробы от больного (пунктат из бубона, соскоб из зева, отделяемое из глаза и др.), пробы из окружающей среды (вода, смывы, суспензии органов грызунов, кровь, кровососущие членистоногие и др.), бактериальные культуры.

295

Отбор проб осуществляется с соблюдением правил асептики, стерильным инструментом в одноразовые ёмкости. Обеззараживание материала, подлежащего исследованию, проводят согласно МУ 3.5.5-1034-01 мертиолятом натрия (1:10000) с последующей обработкой лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом и прогреванием при 65оС в течение 15 мин.

Пробы крови, содержимого бубона, мазков из зева и с коньюктивы глаза, отделяемого язвы исследуют без предварительной подготовки, отбирая для анализа по 0,1 мл нативного материала в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

К мокроте (1–2 мл) добавляют равный объем приго-

товленной ex tempore смеси NALC (0,25 г N-ацетил-L-

цистеина, 25 мл 4% раствора NaOH, 25 мл 0,1 М тризамещенного цитрата натрия или набор Муколизин, ИнтерЛабСервис). Перемешивают покачиванием в течение 20–30 с. Смесь инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем разводят 0,067 М фосфатным буфером (рН 6,8) до 50 мл. Центрифугируют в течение 15 мин при 10000 об/мин. Осадок используют для выделения ДНК.

Кусочки органов массой до 10 г растирают в стерильной ступке со стеклянным порошком, после чего добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида в соотношении 1:5 (вес/объем). Надосадочную жидкость отбирают с помощью пипетки через ватный тампон в отдельную пробирку.Центрифугируютвтечение15минпри12000 об/мин, осадок суспендируют в физиологическом растворе и используют для выделения ДНК. Подготовку гидробионтов осуществляют аналогичным образом. Блох перед исследованием усыпляют эфиром, нанося каплю эфира на ватно-марлевую пробку. Ссыпают в стерильную ступку, куда вносят 0,5 мл 0,9% раствора

296