6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

тельно смешивают и выливают на поверхность агара. Чашки оставляют при комнатной температуре с приоткрытыми крышками на 30 мин. В центр квадратов наносят штампом-репликатором, стандартной петлей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой по капле фагов в соответствующих разведениях. После подсыхания капель чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат при температуре 37±0,5°С. Результаты учитывают через 2-4 ч и 18-20 ч. Наличие лизиса в виде одного «стерильного» пятна или группы мелких негативных колоний оценивается как положительный результат.

Определение чувствительности к полимиксину В

В расплавленный и остуженный до 45°С питательный агар (рН 7,2±0,1) добавляют полимиксин В из расчета 50 единиц на 1 мл среды. После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри. На застывшие агаровые пластинки наносят обычной бактериологической петлей 18или 3-часовую бульонную культуру. Результаты учитывают после инкубирования посевов при 37°С в течение 18 ч. Холерные вибрионы биовара cholerae не растут на полимиксиновом агаре, биовараeltor - признак вариабелен.

Постановка реакции гемагглютинации

На предметное стекло, помещенное в чашку Петри наносят каплю физиологического раствора и суспендируют в ней петлей 18-часовую агаровую культуру. Затем добавляют каплю 2,5% взвеси куриных эритроцитов, трижды отмытых физиологическим раствором. Стекло покачивают до смешивания взвеси эритроцитов и вибрионов. При положительной реакции в течение 1 мин наступает склеивание эритроцитов. Реакцию сопровождают двумя контролями: а) в каплю физиологического раствора добавляют каплю 2,5%

267

взвеси эритроцитов; б) в капле физиологического раствора суспендируют испытуемую культуру. Контроли должны быть отрицательными. Для постановки пробы могут быть использованы эритроциты морской свинки.

Постановка реакции Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол)

См.выше.

Оценкаэпидемическойзначимостихолерныхвибрионов Определение гемолитической активности (по Грейгу)

К 1 мл 18-24-часовой культуры, выращенной в 4-5 мл мясо-пептонного бульона или сердечно-мозгово- го инфуза, добавляют 1 мл 1% взвеси трижды отмытых эритроцитов барана в физиологическом растворе. Смесь микробов и эритроцитов осторожно перемешивают встряхиванием и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37±0,5°С, а затем в холодильник до следующего дня. Предварительный учет результатов проводят через 2 ч, окончательный - на следующий день. При положительной реакции наступает полный или частичный лизис эритроцитов (лаковая кровь). В контроле (1 мл бульона + 1 мл взвеси эритроцитов) гемолиз отсутствует. Чистоту опыта следует контролировать путем высева «смеси» на агаровую среду.

Для постановки пробы Грейга может быть использована дефибринированная кровь барана, консервированная борной кислотой или консервантом Алсевера. Консервированные эритроциты сохраняют свои свойства в течение 3-х месяцев. Перед постановкой пробы на гемолиз дефибринированную кровь центрифугируют при 2-3 тыс. оборотов/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют, а осевшие эритроциты отмывают физиологическим раствором 2-3 раза с про-

268

межуточным центрифугированием до получения прозрачной надосадочной жидкости. Из отмытых эритроцитов приготавливают 1% взвесь в физиологическом растворе, которую можно хранить при 4°С 2-3 дня и использовать для постановки пробы Грейга описанным выше способом.

Определение эпидзначимости холерных вибрионов эльтор комплексным методом

Определение производят с помощью диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx+ и ctx- в соответствии с наставлением к препаратам и гемолитической активности.

Методику определения гемолитической активности см. выше.

Дляпостановкипробысфагомиспользуютметодагаровых слоев. Испытуемую культуру в объеме 0,5 мл добавляют пипеткой в пробирку с 5,0 мл 0,5-0,7% агара Мартена рН 7,6±0,2, расплавленного и охлажденного до 45±0,2°С. После перемешивания все содержимое выливают на подсушенную поверхность агара Мартена рН 7,6±0,2 в чашки Петри. После застывания слоя агара с культурой на его поверхность наносят цельные фаги ctx+ и ctx-. После высыхания капель фагов чашки переворачивают агаром вверх и инкубируют при

37±0,5°С.

Определение токсигенности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков

Для заражения животных используют 4-часовую агаровую культуру, выращенную при температуре 37±0,5°С или 18-ти часовую - при температуре 20±1°С. Необходимо использовать две заражающие дозы 1x105 и 1x107 м.кл., которые вводят внутрикишечно в объеме по 0,2 мл двум кроликам. Заражающую дозу контролируют путем высева на две чашки щелочного агара

269

0,1 мл взвеси из разведения 1x103 м.кл./мл. Кроликов 10-12 дней, весом 130-160 г фиксируют к станку брюшком вверх, выстригают шерсть на операционном поле

исмазывают его йодом. Дают эфирный или внутримышечно тиопенталовый наркоз (0,2 мл 1% р-ра на 100 г веса). Делают разрез длиною 1 см по средней линии живота на уровне пупка. Извлекают петлю тонкого кишечника на длинной брыжейке, фиксируют с помощью мягкого пинцета и вводят взвесь вибрионов. Петлю погружают в брюшную полость. Брюшную стенку и кожу послойно зашивают. Шов смазывают йодом. Оперированных крольчат кормят с помощью шприца молоком и наблюдают 48 ч. Всех погибших

иумерщвленных через 48 ч животных вскрывают и производят высев содержимого кишечника на чашки щелочного агара. Наиболее выраженные изменения наблюдаются в толстом кишечнике, который растянут бесцветной или светло-желтой, прозрачной или слегка опалесцирующей жидкостью. Слепая кишка и прилегающие отделы толстого кишечника могут быть настолько растянуты, что сквозь них видны подлежащие петли кишечника, что создает видимость полной прозрачности кишечного содержимого. Тонкий кишечник расширен и также заполнен полупрозрачным содержимым. Описанные изменения характерны для «синдрома холерогенности», наблюдаемого при заражении эпидемически опасными, содержащими ген холерного токсина штаммами.

8.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТУЛЯРЕМИИ

8.1.Биологические свойства возбудителя туляремии

Туляремия является острым инфекционным при-

270

родно-очаговым заболеванием с поражением лимфатических узлов, паренхиматозных органов, кожных покровов, иногда глаз, зева, легких и сопровождается выраженной интоксикацией. Заболевание преимущественно встречается в ландшафтах умеренного климатического пояса Северного полушария.

Основным резервуаром и источником инфекции при туляремии являются многочисленные виды диких грызунов, зайцеобразные и др. Основная роль в поддержании инфекции в природе принадлежит грызунам (водяная крыса, обыкновенная полевка, ондатра и др.). Больной человек не опасен для окружающих.

Механизм передачи заболевания множественный, чаще всего трансмиссивный. Возбудитель сохраняется в природе в цикле «клещ-животное», передается сельскохозяйственным животным и птицам клещами и кровососущими насекомыми. Специфические переносчики туляремии – иксодовые клещи. Человек заражается туляремией в результате прямого контакта с животными (снятие шкур, сбор павших грызунов и др.), а также алиментарным путем через инфицированные грызунами пищевые продукты и воду. Часто заражение происходит через кровососущих переносчиков (клещи, комары, блохи, слепни и другие членистоногие). Возможно заражение и аспирационным путем (при вдыхании инфицированной пыли от зерна, соломы, овощей). Зарегистрированы случаи заболеваний людей на производствах, связанных с переработкой природного сырья (сахарные, крахмалопаточные, спиртовые заводы, элеваторы и т.п.), на мясокомбинатах, при забое овец и крупного рогатого скота, на котором имелись инфицированные клещи.

Пути заражения: контактный (через кожу и слизистую оболочку глаз), трансмиссивный (при укусе пе-

271

реносчика), алиментарный (через ЖКТ), аспирационный (через дыхательные пути).

Возбудитель туляремии относится к γ–подклассу прото протобактерий, семейству Francisellaceae, роду

Francisella, который включает два вида: F. tularensis и

F.philomiragia.

Впределах вида F. tularensis выделяют 4 подвида: F. tularensis subsp. tularensis или nearctica - неарктический, F. tularensis subsp. holarctica – голарктический,

F. tularensis subsp. mediasiatica - среднеазиатский и F. tularensis subsp. novicida. Подвид holarctica включает в

себя три биологических варианта: japonica - японский биовар, биовар I Ery(S) (эритромицинчувствительный) и биовар II Ery(R) (эритромицинрезистентный).

Внутривидовая дифференциация возбудителя туляремии основывается на различиях подвидов и биоваров по ряду фенотипических признаков: биохимической активности, степени патогенности для человека и животных,чувствительностикнекоторымантибиотикам, на особенностях экологии возбудителя и его ареале. На генотипическом уровне подвиды различаются при VNTR – анализе генома. На территории России встречается F. tularensis подвида holarctica с двумя биоварами – I Ery(S) и II Ery(R), циркуляция которых осуществляется главным образом среди грызунов и зайцеобразных. Распространение их также возможно через иксодовых клещей и водные объекты.

Возбудитель туляремии F.tularensis в мазках 1–2 су - точной культуры, выращенной на плотных питательных средах, представляет собой кокковидные клетки диаметром 0,3–0,5 мкм. В мазках, приготовленных из культуры с жидких питательных сред, туляремийный микроб имеет форму коротких палочек. В тканях животных, погибших от туляремии, возбудителя об-

272

наруживают в виде коккобактерий. При длительном выращивании на питательных средах туляремийные бактериипроявляютзначительныйполиморфизм:встречаются как более крупные, шарообразные до 3 мкм в диаметре клетки, так и мельчайшие до 0,1–0,2 мкм.

Туляремийные бактерии неподвижны, грамотрицательны, но окрашиваются бледнее анилиновыми красителями, чем другие грамотрицательные бактерии, размножаются почкованием, спор не образуют, выделяют капсулоподобное слизистое вещество. Слизистую консистенцию культуры выявляют в окрашенных мазках и при эмульгировании бактериальной массы в капле физиологического раствора (культура тянется за петлей). В мазках, окрашенных по Граму, обильную слизь обнаруживают в виде сплошной тонкой сеточки розового цвета.

Бактерии туляремии – факультативные анаэробы. Оптимальная температура их выращивания 36-38 ºС, при более низкой температуре размножение происходит медленнее, а ниже 20 ºС – прекращается. Оптимальная концентрация водородных ионов в средах для выращивания туляремийного микроба 6,8-7,3. Возбудитель туляремии не растет на обычных питательных средах – МПА и МПБ (исключение – F. tularensis subsp. novicida), а требует для своего выращивания среды, содержащиекровь,яичныйжелтокилиихзаменители. На этом основана дифференциальная диагностика туляремийного микроба. Из плотных питательных сред, применяемых для выращивания F. tularensis, наиболее распространена свернутая желточная среда Мак-Коя. Культура туляремийного микроба на ней растет в виде извилистого, блестящего, нежного, почти бесцветного, слизистого налета, хорошо снимающегося петлей. Поверхность посева состоит из множества слившихся

273

мелких колоний, напоминающих «шагреневую кожу». Ростввидеотдельныхколонийвстречаетсятолькопри посеве из органов животных со скудным содержанием туляремийных бактерий и появляется в более поздние сроки (на 9–12 сутки).

Наравне со свернутой желточной средой Мак-Коя для выращивания возбудителя туляремии используют кровяную среду Емельяновой, FТ-агар, среды, приготовленные на основе сухого агара для выращивания туляремийного микроба, в том числе с добавлением антибиотиков.

Культура в S-форме на кровяной среде Емельяновой вырастает в виде круглых с ровными краями, равномерно выпуклых, гладких, слабо блестящих беловатого цвета гомогенных колоний, размером до 1–2 мм в диаметре. Бактерии, образующие колонии в S-форме, высоковирулентны для лабораторных животных, колонии слабовирулентных штаммов (SR-форма) более крупных размеров. Авирулентные культуры вырастают в R- форме и агглютинируются трипафлавином. Туляремийные бактерии слабо ферментируют до кислоты лишь немногие углеводы и спирты на специальных средах. Среды Гисса для этого не пригодны. Ферментирующая способность у разных подвидов туляремийного микроба неодинакова (таблица 17).

Таблица 17 Характеристика F. tularensis (по подвидам)

и F. philomiragia

274

275

Примечание: н/д – нет данных, +(–) – признак характерен для большинства выделенных штаммов.

Липополисахарид туляремийного микроба является основным иммунодоминантным антигеном и мишенью специфического антительного ответа макроорганизма на возбудитель. На выявлении специфических туляремийных антител против эпитопов ЛПС основана серологическая диагностика туляремии у человека и животных. Структура и антигенная специфичность ЛПС бактерий F. tularensis трёх основных подвидов (кроме F. tularensis subsp. novicida) идентична. В отличие от классических эндотоксинов, препараты ЛПС возбудителя туляремии характеризуются биологической инертностью – они являются слабыми индукторами цитокинов и не токсичны для лабораторных животных. Экзотоксин у бактерий туляремии не обнаружен. Для человека высокопатогенен подвид tularensis, подвиды holarctica и mediasiatica умеренно па-

276