5 курс / Инфекционные болезни / Доп. материалы / Серов_В_В_,_Апросина_З_Г_Хронический_вирусный_гепатит2
.pdfХронический вирусный гепатит
ферация клеток, сочетающаяся с повреждением их генома. Многостадийность гепатокарциногенеза хорошо изучена на клеточ ном уровне. Известно нарастание риска развития ГЦК по мере длительности течения инфекции (десятилетия) и выраженности цирротического процесса. Показано, что риск развития ГЦК особенно высок у больных циррозом печени с патологическими маркерами высокой пролиферативной активности и дисплазии гепатоцитов [Borzio М. et al., 1998]. Цирроз печени как таковой (независимо от его этиологии) рассматривается как важный фактор развития ГЦК. При HCV-инфекции это один из наибо лее значимых факторов риска.
Многостадийность канцерогенеза при HCV-инфекции про слеживается и на генетическом уровне. По мере развития забо левания печени происходит накопление генетических мутаций в хромосомах пролиферирующих гепатоцитов. В процесс гене тической модификации включаются, как правило, последова тельно множество клеточных генов, что вызывает вначале иммортализацию клетки, а затем уже ее трансформацию. Показано, что генетические нарушения (в частности, делеции в гене р53) могут иметь место на стадии цирроза печени, т.е. предшествовать прогрессированию в ГЦК [Kishimoto Y. et al., 1997]. Предшество вание генетических изменений опухолевой трансформации, а также функции подвергающихся мутациям генов (регулирование дифференциации и клеточного роста) дают основание считать, что генетические изменения в клетках являются причиной (а не результатом) малигнизации.
М олекулярно-генетические исследования самых последних лет выявили при ГЦК мутации (главным образом соматиче ские) значительного числа клеточных генов. Эти генетические мутации не являются специфичными только для ГЦК, так как они встречаются при опухолях другой локализации. Они такж е встречаются при ГЦК, развившейся и в отсутствие действия HBV и HCV. Частота каждой отдельно взятой мутации при ГЦК невысока. Однако эти мутации не являются случайными, так как касаются протоонкогенов и генов-супрессоров опухо левого роста, осуществляющих регуляцию клеточного роста.
Выделяют по крайней мере 4 основных (связанных меЖДУ собой) механизма регуляции роста клеток, п о в р еж д аю щ и х ся при гепатокарциногенезе [Ozturk М., 1999].
Первый механизм опосредован геном р53 (локализован в 17р хромосоме) и представляет собой ответ на повреждение ге' 78
Патогенез хронической инфекции
нома. Известно, что кодируемый этим геном белок вовлечен в различные клеточные процессы (прекращение клеточного цикла, апоптоз, дифференциацию, ангиогенез и др.) и является супрессо ром опухолевого роста. Частота мутации гена р53 при ГЦК варьи рует от 15% в Европе до 42% в Китае, составляя в среднем
около 30%.
Второй механизм опосредован генами ретинобластомы (RB1), cyclin D и р 16. Мутации каждого из этих генов встречаются при ГЦК с частотой 10-20%, но их сочетание ведет к наруше нию контроля клеточного цикла более чем при 30% ГЦК.
Третий механизм заключается в нарушении функции транс формирующего фактора роста - tumor growth factor-(3 (TGF-J3) -
и опосредован генами, кодирующими рецепторы |
M 6P/IGF2R |
(m annose-6-phosphate/insulin-like growth factor 2 |
receptor) и |
внутриклеточные медиаторы TG F -в. Частота мутаций этих ге нов при ГЦК составляет около 25%.
Четвертый механизм опосредован геном (З-catenin, геном АРС (adenomatosis poliposis coli) и некоторыми другими генами и ответствен за наруш ение внутриклеточной трансдукции сигналов, поступающих от протоонкогенов и воспринимаемых клеточными рецепторами.
Таким образом, неконтролируемая пролиферация опухоле вых клеток может быть обусловлена нарушением регуляции механизмов внутриклеточной трансдукции сигналов, что пока зано при HCV -инфекции [Ozturk М., 1999; Hayashi J. et al., 1999]. Значительное число генов, вовлекающихся в гепатокарциногенез с различной частотой и в различных сочетаниях, свидетельствует о генетической гетерогенности ГЦК, которая может быть следствием гетерогенности ее этиологических факто ров, а также объяснять хорошо известную фенотипическую гете рогенность данной опухоли [Ozturk М., 1999; Colombo М., 1999]. В этом плане представляет интерес наблюдение больного с HCVинфекцией, в печени которого в одном большом узле-регенерате уэкспрессирующем нормальный ген р53) были выявлены 2 ги стологически различных опухолевых узла, экспрессирующих Различные мутантные формы гена р53 [Oda Т. et al., 1994].
|
СслеД°вания |
последних лет получают все больше доказа- |
|
ЛеноСТВ т°го, что |
повреждение генома клетки хозяина обуслов- |
||
т |
ВЗаимодействием HBV или HCV |
с клеточными генами, |
|
бол лРямыми онкогенными эффектами |
вирусов. Эти эффекты |
||
|
полно изучены для HBV-инфекции, при которой до 20- |
79
Хронический вирусный гепатит
50% случаев ГЦК развивается без предшествующего цирроза печени. Известны наблюдения ГЦК в детском возрасте.
ГЦК у больных с HCV-инфекцией практически всегда раз. вивается на фоне цирроза печени и, как правило, у лиц пожи лого возраста [Colombo М., 1999]. Хотя и HCV RNA, и вирус, специфические белки HCV обнаруживаются в клетках ассо циированной с HCV-инфекцией ГЦК, геном HCV не способен к интеграции в геном клетки хозяина. Эти факторы дают осно вание для сомнений в наличии прямого онкогенного действия HCV. Тем не менее в пользу онкогенности HCV свидетельствуют результаты исследований, установивших, что Сог-протеин вызы вает трансформацию эмбриональных фибробластов крысы в ту морогенный фенотип [Ray R.B. et al., 1996], ингибирует апоптоз в культуре клеток [Ray R.B. et al., 1996, 1998], индуцирует развитие ГЦК у трансгенных мышей [Moriya К. et al., 1998] Показано, что Сог-протеин способен модулировать транскрип цию ряда генов, в том числе супрессоров опухолевого роста (р53) [Ray R.B. et al., 1997, 1998]. Онкогенный потенциал HCV связывают с Сог-протеином, локализация которого в ядрах ге патоцитов неоднократно демонстрировалась. Кроме того, име ются данные в пользу онкогенного потенциала некоторых не структурных белков HCV (NS3, NS4B, NS5) [Sakamuro D. et al., 1995; Kato N. et al., 1997; Park J.S. et al., 2000].
Дальнейшие исследования на молекулярно-генетическом уровне позволят приблизиться к пониманию механизмов пре вращения нормальной клетки в опухолевую и роли вирусов ге патита в этом процессе.
3.3. ПАТОГЕНЕЗ HBV- И HCV-ИИФЕКЦИЙ НА ФОНЕ АЛКОГОЛЬНОЙ ПЕЧЕНИ
В последние годы в связи с идентификацией нескольких ви русов гепатита стало возможным выделить группу больных хроническими заболеваниями печени, связанными как со злоупотреблением алкоголем, так и с персистенцией вирусов гепа тита В, С и D [Хазанов А.И., 2000].
3.3.1. АЛКОГОЛЬНАЯ БОЛЕЗНЬ ПЕЧЕНИ
В группу алкогольной болезни печени (АБП) включают Жй' ровую печень (стеатоз), алкогольный гепатит и цирроз печей1 [Мухин А.С., 1980; Серов В.В., Лапиш К., 1989]. В послеД' ние годы понятие АБП расширено за счет включения алК°
80
Патогенез хронической инфекции
г о л ъ н о г о фиброза печени [French S.W. et al., 1993]. Диагноз дБ П наряду с клиническими признаками висцеральных пора жений, свойственных хроническому алкоголизму, основывается в большей степени на данных морфологического изучения пече ни V части больных, злоупотребляющих алкоголем, при ги стологическом исследовании выявляется картина хронического активного гепатита (ХАГ), трактовка которого при АБП трудна и требует исключения инфекции вирусов гепатита В и С [Takase S. et al., 1991]. Допускают возможность формирования ХАГ вследствие включения алкоголь-индуцированных иммунных механизмов прогрессирования АБП [Takase S. et al., 1991]. В ред ких случаях отмечается развитие алкогольной пенистой дегенера ции [Ushida Т. et al., 1983] и веноокклюзивных повреждений [Goodman Z.D., Ishak K.G., 1982], которые могут определить неблагоприятный прогноз заболевания.
Основным механизмом формирования АБП является прямое цитопатическое действие ацетальдегида [Lieber С .S., 1997]. Он способен связываться с гемоглобином, альбумином, тубулином (основным белком цитоскелета), трансферрином, коллагеном I и II типа, цитохромом Р4502Е1, формируя стабильные соеди нения, длительно персистирующие в печени, несмотря на за вершение метаболизма этанола [Saunders W.B. et al., 1993]. Со единения ацетальдегида с трансферрином и гемоглобином при водят соответственно к образованию десиалотрансферрина и ацетальдегид-модифицированнош гемоглобина, рассматриваемых в настоящее время как наиболее чувствительные (81%) и спе цифические (98%) маркеры злоупотребления алкоголем у боль ных АБП [Wickramasinghe S.N. et al., 1994]. С наличием десиа лотрансферрина в последнее время связывают нарушения об мена железа: показано, что он обладает повышенной способ ностью селективно доставлять железо к гепатоцитам, обуслов ливая наряду с алкоголь-индуцированным повышением абсорб ции железа из желудочно-кишечного тракта [Duane P. et al., 1992] появление сидероза печени. Установлено также, что связыва ние ацетальдегида с основными белками цитоскелета (тубулином, актином) может приводить к необратимому клеточному повреж дению и развитию баллонной дистрофии [Tuma D.J. et al., 1991]. Стабильные соединения ацетальдегида с белками экстрацеллюлярного матрикса, расположенного в перисинусоиДальном пространстве Диссе, способствуют фиброгенезу и мо- ^ приводить к развитию фиброза [Holstege A. et al., 1994].
Хронический вирусный гепатит
Алкоголь и его метаболиты трансформируют гепатоциты из взаимосвязанных функционирующих единиц в изолированные клетки с нарушенными внутри- и внеклеточными связями. В ре зультате дефенестрации эндотелиальных клеток и коллаген изации пространства Диссе создается барьер для поступления питатель ных веществ в клетку. Дезорганизация мембраны гепатоцитов, гипоксия, уменьшение пула митохондриального глутатиона, по вреждение микрофиламентов приводят к "внутриклеточному хао су". Эффект этих повреждений в сочетании с ингибированием регенерации гепатоцитов обусловливают клинико-морфологиче ские проявления АБП [French S.W. et al., 1993].
В то время как патогенез жировой печени хорошо известен, патогенез алкогольного гепатита и цирроза печени остается недо статочно изученным. В последние годы получает подтверждение и развитие давно высказанное предположение о роли аутоим мунных механизмов в прогрессировании АБП [Zetterman R., Sorrel М., 1981].
Важное значение в патогенезе алкогольного гепатита придают активации цитокинового каскада. Показано, что лихорадка, нейтрофилез, снижение сывороточного железа и повышение у- глобулинов сыворотки обусловлены цитокин-индуцированным острофазовым ответом. Проявлениями биологического эффекта фактора некроза опухоли (ФИО) служат нейтрофилез, лихо радка, а также гипотония в тяжелых случаях алкогольного ге патита [Thiebe D.L., 1989]. Обнаружена корреляция между уровнем цитокинов (ФИО, интерлейкин-6, интерлейкин-8) и тяжестью алкогольного гепатита [Honchel R. et al., 1992; Diczruiz A., 1993]. Интерлейкин-6 (ИЛ-6) усиливает действие ФИО. Интерлейкину-8 придают основное значение в хемотаксисе и активации нейтрофилов. Основной причиной повышения уровня ФНО при алкогольном гепатите считают эндотоксемию, разви вающуюся вследствие повышенной проницаемости слизистой оболочки кишечника, и алкоголь-индуцированной депрессии ретикулоэндотелиальной системы печени (снижение клиренса эндотоксинов купфсровскими клетками) [Honchel R. et al., 1992].
Нарушения гуморального иммунитета при АБП представле ны гипергамма-глобулинемией, появлением н е с п ец и ф и ч е ск и х аутоантител, антител к печеночноспецифическим антигенам и ан тител к ацетальдегид-эпитопам в сыворотке крови
F., 1993].
82
Патогенез хронической инфекции
В последнем исследовании С. Laskin и соавт. (1990) у 87% больных АБП выявлялся хотя бы один класс аутоантител в низком титре: антитела к ДНК, антилимфоцитарные антитела, антинуклеарный фактор. При АБП могут обнаруживаться анти тела к печеночноспецифическим антигенам. К ним относят ан титела к асиалогликопротеиновым рецепторам и детерминан там мембран гепатоцитов. Возможность изменения этих детер минант под воздействием этанола была подтверждена выявле нием специфического связывания антител сыворотки крови больных АБП с гепатоцитами животных, получавших этанол. A L M - A b (антитела к алкоголь-измененным печеночным мем бранам) класса IgG с высокой частотой обнаруживаются при АБП и коррелируют с прогрессированием поражения печени [Izumi N. et al., 1989; Takase S. et al., 1993].
Гипер-у-глобулинемия с превалированием уровня IgA в сы воротке свойственна АБП. A. Van de Wiel и соавт. (1987) уста новили корреляцию между уровнем IgA, количеством потреб ляемого алкоголя и тяжестью поражения печени.
В генезе гипер-у-глобулинемии играют роль два основных механизма: избыточная антигенная стимуляция и гипериммунный ответ вследствие нарушения Т-клеточной регуляции В- клеток. К основным формам избыточной антигенной стимуля ции относят индуцированное алкоголем повышение проницае мости слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта для бактериальных и пищевых антигенов (эндотоксины) с после дующим нарушением их дезактивации в условиях депрессии клеток Купфера [Honchel R. et al., 1992]. В последние годы основным механизмом формирования гипер-у-глобулинемии считают образование неоантигенов, которое происходит при взаимодействии ацетальдегида с белками гепатоцита [Koskinas J.
et al., |
1992; Clot P. et al., 1995; |
Clot P. et al., 1995]. Наряду с |
этим |
получены доказательства |
повыш ения супрессорной ак |
тивности Т-клеток, сопровождающейся избыточной секрецией IgA, IgG В-клетками [Giron J.A. et al., 1992].
Отражением повышенного уровня IgA в сыворотке является отложение последних в тканях печени и почек при АБП. У 75% ольных АБП выявляются депозиты IgA вдоль синусоидов в Печени (в то время как при поражениях печени другой этиологии они обнаруживаются менее чем в 10% случаев) [Van de Wiel A. et а •' 1987]. у 20-50% больных АБП депозиты IgA выявляются и в ткани почек наряду с отложением IgG, М и СЗ [Montoliu J. et
83
Хронический вирусный гепатит
al., 1986]. Роль депозитов IgA в тканевом повреждении остава лась до недавнего времени неясной. J.Deviere и соавт. (1991) выявили IgA-зависимую стимуляцию моноцитов в ответ на выра ботку ФНО - основного цитотоксического цитокина. В настоящее время в генезе иммунологических нарушений и прямой клеточной токсичности ключевое значение придают ковалентному связыва нию ацетальдегида с клеточными белками [Tuma D.J., Klassen L.W., 1993]. Стабильные соединения ацетальдегида с клеточными бел ками распознаются иммунной системой как неоантигены и запускают иммунные механизмы ответа. У злоупотребляющих алкоголем лиц в сыворотке крови и ткани печени выявлены антитела к эпитопам белков, модифицированным ацетальдегидом (АМЕ) [Clot P. et al., 1995]. Впервые J.Koskinas и соавт. (1992) связали наиболее частое нарушение гуморального им мунитета при АБП - повышение уровня IgA - с формирова нием соединений ацетальдегида с белками. Авторы выявили антиген, который распознавался антителами класса IgA у 70% больных алкогольным гепатитом и циррозом печени и у 20% алкоголиков без поражения печени. Обнаружена корреляция между типом атител к ацетальдегид-модифицированному эпи топу (АМЕ), тяжестью поражения печени и количеством при нимаемого алкоголя: IgA-антитела выявляются в очень низком титре при стеатозе и неактивном ЦП. В то же время у 80% больных острым алкогольным гепатитом и активным алкоголь ным циррозом печени концентрация АМЕ обнаружена пре имущественно в перивенулярной зоне и сочеталась с воспали тельным клеточным инфильтратом [Holstege A. et al., 1994].
Нарушения клеточного иммунитета при АБП также выраже ны. Показано, что стабильные соединения ацетальдегида могут оказывать влияние и на клеточный иммунитет, что ацетальдегидмодифицированные клетки селезенки способны вырабатывать цитотоксический Т-клеточный ответ [Terabayashi Н., Kolber М.А., 1990]. У больных АБП отражением нарушения клеточного имму нитета является лимфоцитарная инфильтрация ткани печени, которая возрастает при естественной эволюции алкогольного гепатита в условиях абстиненции, а также при активном алко гольном циррозе печени. Ряд авторов показали, что количество CD8 Т-лимфоцитов в ткани печени при остром алкогольном гепатите подобно таковому при хроническом гепатите В, что подтверждает роль цитотоксических Т-лимфоцитов в повреЖ' дении гепатоцитов [Sakai Y. et al., 1993].
84
Патогенез хронической инфекции
Влияние стабильных соединений на иммунную систему по лучило обоснование в работе H.Yokoyama и соавт. (1993). При иммунизации ацетальдегид-модифицированным гемоглобином морских свинок, получавших этанол, авторы воспроизвели экспериментальный гепатит, гистологическая картина которого включала лимфогистиоцитарную инфильтрацию портальных трактов и перивенулярных зон с формированием лимфоидных фолликулов. У свинок, получавших только этанол или иммуни зированных ацетальдегид-модифицированным гемоглобином без этанола, изменения в ткани печени не выявлялись.
Предполагается, что внепеченочная циркуляция соединений ацетальдегида с белками может обусловливать алкоголъ-инду- цированное повреждение других органов и тканей при алкого лизме и АБП [Wickramasinghe S.N. et al., 1987].
Ацетальдегид-модицифированные эпитопы являются не един ственными неоантигенами, образующимися в процессе метабо лизма этанола. При его окислении в микросомах (М ЭОС с участием цитохрома Р4502Е1) образуются гидроксиэтиловые радикалы, способные связываться с белками, в том числе с ци тохромом Р4502Е1 [Clot P. et al., 1996]. После гибели гепатоцита появляются пептиды, содержащие гидроксиэтиловые группы, способные индуцировать иммунный ответ. P.Clot и соавт. (1996) показали наличие IgG, IgA антител против гидроксиэтиловых радикалов в соединении с цитохромом Р4502Е1 у больных ал когольным циррозом печени и не выявили их у больных с цир розом печени другой этиологии. Эти же авторы установили, что существуют две популяции аутоантител: против гидроксиэти ловых радикалов с Р4502Е1 и против АМЕ, не дающих пере крестного реагирования. Главными антигенами аутоиммуните та при АБП являются соединения гидроксиэтиловых радикалов с Р4502Е1, которые могут быть использованы в качестве мар керов тяжести при АБП [Dupont I. et al., 1998].
3-3 2 НВУ-ИНФЕКЦИЯ И АЛКОГОЛИЗМ
Сывороточные маркеры HBV в 2-4 раза чаще выявляются у лиц, злоупотребляющих алкоголем, чем в популяции [Laskus Т. et а1-, 1992]. В Австрии, где 47 из 100 ООО человек ежегодно уми рают от цирроза печени и где алкоголь является главным его
1о^°ЛОГИЧеским фактором, HBs Ag определяется в сыворотке у
0 мужчин и 6% женщин, страдающих циррозом печени, по Равнению с 0,5% в популяции [Rogers А.Е., Conner M.W. et al.,
85
Хронический вирусный гепатит
1986]. В отличие от HCV-инфекции, по-прежнему нет четких доказательств преимущественного выявления маркеров HBV-ин фекции при алкогольном циррозе печени по сравнению с други ми формами АБП [Nalpas В. et al., 1985].
Ряд авторов при статистической обработке материала не вы явили роль HBV в усугублении клинико-биохимических показате лей и прогрессировании АБП [Lacet С.М., Strauss Е., 1993]. Одна ко эти же авторы у больных АБП с Н Bs-антигенемией, как прави ло, обнаруживали далеко зашедший цирроз печени (стадия С, по Child-Pugh) с неблагоприятным прогнозом, что отмечено и дру гими авторами [Watanabe A. et al., 1985]. E.Villa и соавт. (1982) показали, что прием этанола в нетоксических дозах для лиц с бессимптомной HBs-антигенемией представляет высокий риск развития поражения печени.
У больных с персистирующей HBs-антигенемией и злоупотреб ляющих алкоголем в дозе более 60 г в сутки значительно чаще выявляется морфологическая картина хронического активного гепатита с более высоким индексом гистологической актив ности по сравнению с больными, не употребляющими алкоголь или употребляющими его в меньших дозах [Murata Т. et al., 1990]. У больных HBs Ag- и НВе Ag-положительным гепатитом, злоупотребляющих алкоголем, не отмечено различий в актив ности ДНК-полимеразы сыворотки по сравнению с больными, не употребляющими этанол, однако выявлено значительное увеличение уровня виремии при количественном определении HBV-ДИК [Ohta Y. et al., 1988].
Несмотря на высокую частоту выявления маркеров HBV у больных АБП, по-прежнему неясно, является ли эта связь си нергичной, независимой, или повреждение печени одним из этиологических агентов (например, алкоголем) может повы шать уязвимость гепатоцитов к воздействию других этиологи ческих агентов.
Механизмы возможного взаимодействия HBV и алкоголя неоднозначны. Умеренная иммуносупрессия при х р о н и ч е с к о м алкоголизме [Paronetto F., 1993] может способствовать ф о р м и р о ванию носительства после ОВГ-В или реактивации ранее суще ствовавшей HBV-инфекции [Brechot С. et al., 1996]. При хрони ческой HBV-инфекции избыточная продукция X-полипептида [Djamantis I.D. et al., 1992] может выступать в качестве
гической мишени или изменить типы экспрессии хозяина [Cross J.C. et al., 1993], приводящих к
86
Патогенез хронической инфекции
генотипов [Ueda Н. et al., 1995] и появлению специфических антивирусных или аутоагрессивных ответов.
Повышенный уровень свободных радикалов, образующихся в микросомальной этанол-окисляющей системе при окислении этанола, и индуцируемая им умеренная иммуносупрессия уси ливают экспрессию Х-антигена [Chen H.S. et al., 1993], под держивающего репликацию HBV, чем объясняют большую час тоту выявления маркеров HBV среди алкоголиков [Brechot С. et al., 1996]. Серьезное внимание уделяют также цитокинам, являющимся важными медиаторами воспаления как при ви русном гепатите, так и при АБП [McClain С. et al., 1993]. При хронической HBV-инфекции отмечается повышенная выработ ка фактора некроза опухоли, которая опосредуется активацией Х-антигена [Marinos G. et al., 1995]. При алкогольном гепатите обнаруживается повышенный уровень этого фактора, коррели рующий с тяжестью повреждения печени [Paronetto F., 1993]. Фактор некроза опухоли при АБП может стимулировать клетки Ито, участвующие в фиброгенезе и формировании цирроза печени. Таким образом, сочетание двух этиологических факторов (HBVинфекция и алкоголь) может утяжелить поражение печени.
Несмотря на высокую частоту выявления HBs Ag в сыворотке у злоупотребляющих алкоголем, этот маркер не отражает истинную распространенность среди них HBV-инфекции [Brechot С. et al., 1996]. Отсутствие HBs-антигенемии в этих случаях рассмат ривается как следствие биохимического эффекта этанола на ин фицированные гепатоциты [Lieber С .S., 1997] и обусловленную им иммуносупрессию, что ведет к изменению как репликации HBV, так и экспрессии вирусных белков. В оценке наличия HBV-инфекции имеет значение чувствительность используе мых диагностических тестов.
Наиболее частыми серологическими маркерами HBV у зло употребляющих этанолом являются HBs Ab и НВс АЬ, причем чаще выявляются только НВс Ab [Coste Т. et al., 1982], свиде тельствующие о перенесенной в прошлом или текущей HBVинфекции. Последнее было подтверждено в работе A.Cross,
^°Her-Jemelka и соавт. (1993). В 153 сыворотках, содержащих изолированные" НВс АЬ, исследовался HBs Ag после предва рительной обработки сыворотки кислотой для диссоциации иммунных комплексов. В 31% этих сывороток обнаружен HBs и в 39% методом ПЦР выявлена HBV ДНК. Более поздние ЛеДования с использованием nested ПЦР и спектрометрии
87