5 курс / Инфекционные болезни / Доп. материалы / Серов_В_В_,_Апросина_З_Г_Хронический_вирусный_гепатит2
.pdfХронический вирусный гепатит
шинство вирусов, резистентных к фамцикловиру, обнаруживается у "иммуноскомпрометированных" больных, но наблюдается и у иммунокомпетентного хозяина при длительном лечении этим препаратом.
2.2. ВИРУС ГЕПАТИТА D
HDV - сферическая частица со средним диаметром 36 нм, состоящая из ядра (HD Ag) и внешней оболочки, образованной поверхностным антигеном вируса В.
Геном HDV представлен однонитевой, циклической моле кулой РНК, состоящей приблизительно из 1700 нуклеотидов. Характер плотной упаковки генома определяется высокой сте пенью комплементарности нуклеотидов, входящих в его состав. В геноме имеется несколько открытых рамок считывания, как на геномных, так и на антигеномных нитях РНК. В РНК зако дирован вирусспецифический полипептид - HD Ag (пятая от крытая рамка считывания, локализованная на комплементар ной зоне РНК HDV). D-антиген локализуется в ядрах инфици рованных гепатоцитов, в ядрышках и/или нуклеоплазме, имеет выраженную РНК-связывающую активность.
HDV является дефектным вирусом, который для своей экс прессии, репликации и индукции гепатита требует вспомога тельной функции HBV. Развитие HDV-инфекции возможно только при одновременной репликации HBV. Этот факт опре деляет две формы их взаимодейстия: одновременного инфици рования HBV и HDV - коинфекция и инфицирования HDVносителя вируса гепатита В - суперинфекция. Характер взаимо связи этих вирусов определяется не только использованием HBs Ag для формирования внешней оболочки HDV, но и дру гими, до конца не расшифрованными взаимодействиями. Так, HDV ингибирует репликацию HBV, что ведет к уменьшению экспрессии НВе Ag и HBs Ag и угнетению активности ДНКполимеразы в течение острой инфекции. Одним из возможных объяснений этого факта служат данные о стимуляции HDV внутриклеточного синтеза интерферона, который ингибирует репликацию HBV.
В сыворотке крови D-антиген определяют при помощи иммуноферментного или радиоиммунного анализа (после обработки исследуемого материала неионными детергентами). Для обнару жения D-антигена в ткани печени (биопсия, аутопсия) применяют метод флюоресцирующих антител и иммунопероксидазный метод.
28
Вирусы хронического гепатита
В патогенезе гепатита D основное значение придается цитопатическим механизмам, в противоположность иммуноопосредованному поражению печени при HBV-инфекции. Однако в последние годы это положение подвергается пересмотру. Уста новлено, что в отсутствие иммунного ответа HDV-инфекция не проявляет значительного цитопатического эффекта [Gowans F.Y., Bonino F., 1993; Bichko V. et al., 1994J, и даже при наличии им мунного ответа хозяина она может быть скорее вспомогательной вирусной инфекцией, чем причиной прогрессирующего повреж дения печени [Monsardio У., 1998]. Дальнейшее изучение HDVинфекции с применением методов молекулярной биологии по зволит уточнить патогенез гепатита D [Taylor Y.M., 1999].
Эпидемиология HDV-инфекции аналогична таковой при HBV-инфекции.
HDV-инфекция поражает лиц всех групп риска по развитию гепатита В; часто встречается среди инъекционных наркоманов, у медицинских работников, у лиц, которым многократно перели вают кровь, и т. д. HDV может распространяться при гомо- и ге теросексуальных контактах. Описаны случаи внутрисемейного инфи цирования. ВИЧ-инфекция сопровождается реактивацией HDV.
2.3. ВИРУС ГЕПАТИТА С
Вирус гепатита С идентифицирован в 1989 г. группой аме риканских исследователей под руководством М. Houghton: бы ла клонирована ДНК-копия вируса, вызывавшего парентераль ный гепатит ни А ни В у экспериментально инфицированных шимпанзе [Choo Q.-L. et al., 1989], и разработан метод обнару жения сывороточных антител к рекомбинантному белку этого вируса [Kuo G. et al., 1989], который был назван вирусом гепа тита С (HCV). HCV явился первым вирусом, который удалось идентифицировать на основании расшифровки последователь ности нуклеотидов задолго до его выделения и электронно микроскопической визуализации.
Структура вирусных частиц. Структура вириона изучена не достаточно из-за низкого уровня виремии и отсутствия надеж ных клеточных культур для накопления HCV. Лишь в немного численных исследованиях HCV был визуализирован при электронной микроскопии [Kaito М. et al., 1994; Shimizu Y.K. et al.,
^96]. Это мелкий (с диаметром сферических вирусных частиц До 50 нм) РНК-содержащий вирус, обладающий липидной обо лочкой (инактивация хлороформом).
29
Хронический вирусный гепатит
Показана различная плотность (плавучая плотность в гради енте сахарозы) вирусных частиц, выделяемых из сыворотки крови инфицированных людей и шимпанзе - от 1,06 до 1,20 г/см3. Фракции высокой плотности, как полагают, представляют со бой комплексы вирионов с иммуноглобулинами. Наличие фрак ций вирионов низкой плотности, которые обладают большей инфекциозностью, объясняют связыванием вирусных частиц с сывороточными липопротеинами низкой плотности. Вероятно, липопротеины низкой плотности предохраняют вирус от ней трализации антителами и способствуют проникновению вируса в клетки хозяина путем эндоцитоза [Thomssen R. et al., 1993; Major M.E., Feinstone S.М., 1997].
HCV по сравнению с HBV менее устойчив во внешней сре де. Он легко инактивируется формалином, ультрафиолетовым излучением, а также нагреванием (при температуре +60 °С в тече ние 30 мин, при +100 °С в течение 2 мин), что наряду с низким уровнем виремии обусловливает его более низкую инфекциозность.
Строение генома, организация и процессинг полипептида HCV. Геном HCV представлен однонитевой линейной молеку лой РНК положительной полярности протяженностью около 9600 нуклеотидов. Результаты клонирования и полного секвинирования РНК, а также физико-химические характеристики ви руса позволили определить таксономическую принадлежность HCV к семейству Flaviviridae, выделив в отдельный род hepacivirus.
Род hepacivirus близок по свойствам к представителям двух других родов семейства Flaviviridae - flavivirus и pestivirus, вызывающих ряд инфекций у человека и животных (вирусы лихорадки Денге, желтой лихорадки у человека; вирусы куриной холеры, бычьей диареи и др.). В настоящее время к роду hepacivirus, помимо HCV, отнесены также вирусы GBV-A, GBV-B (вызывающие инфекции у приматов) и GBV-C, или вирус гепатита G (HGV), инфицирующий человека [Houghton М., 1996; Robertson В. et al., 1999].
Результаты многочисленных исследований строения генома HCV, строения и свойств белков HCV обобщены в ряде обзо ров [Houghton М., 1996; Major М.Е., Feinstone S.М., 1997; De Francesco R., 1999]. Установлено, что геном HCV содержит два некодирующих региона и одну большую открытую рамку считывания, кодирующую структурные и неструктурные белки вириона. Высококонсервативному 5'-некодирующему региону
30
Вирусы хронического гепатита
/о4 1 _ 3 4 4 нуклеотидов) принадлежит роль в инициации транс ляции Трансляция открытой рамки считывания ведет к син тезу большого полипептида-предшественника в 3010-3033 ами нокислот (в зависимости от субтипа вируса). В цитоплазме или эндоплазматическом ретикулуме клетки хозяина полипептид подвергается процессингу (разрезанию), который происходит с участием протеаз хозяина и вируса и ведет к образованию по крайней мере 10 белков (рис. 2.2).
Структурные белки |
|
|
Неструктурные белки |
|
||||
* |
* |
* |
* |
* |
♦ |
♦ |
♦ |
♦ |
с |
Е1 |
Е2 |
р7 |
NS2 |
NS3 |
NS4A NS4B |
NS5A |
NS5B |
Аминокислоты |
Белок |
|
1-191 |
С (core) |
|
192 |
-383 |
Е1 |
384 |
-746 |
Е2 |
747-809 |
Р7 |
|
810 |
-1026 |
NS2 |
1027-1657 |
NS3 |
|
1658-1711 |
NS4A |
|
1712-1972 |
NS4B |
|
1973-2420 |
NS5A |
|
2421-3010 |
NS5B |
Функция
Нуклеокапсид Гликопротеин оболочки Гликопротеин оболочки
9
Zn-зависимая Ы52/3-протеиназа Серин-протеиназа РНК-зависимая хеликаза Кофактор для ЫЗЗ-серин-протеиназы
9
Регион, определяющий чувстви тельность к интерферону-альфа (2209-2248)
РНК-зависимая РНК-полимераза
Рис 2 2 Организация и процессинг полипротеина HCV Обозначены места разреза ния * - с помощью сигнальной пептидазы клетки хозяина, ♦ - с помощью вирусной серин-протеиназы, * - с помощью вирусной цинк-зависимой Ы52-3-протеиназы (по R р е Francesco, 1999)
Белок нуклеокапсида - core (С) и два белка оболочки вириона - envelop (El и Е2), являющ иеся структурными белками вириона, а такж е небольш ой белок с неизвестной ф ункцией (р7) кодируются регионом у 5'-конца открытой рамки считыва ния. Эти белки подвергаются процессингу с помощью сигналь ной пептидазы эндоплазматического ретикулума клетки хозяи на. Оставшейся большей частью открытой рамки считывания кодируется б неструктурных белков (NS2, NS3, NS4A, NS4B,
31
Хронический вирусный гепатит
NS5A, NS5B), представляющих собой ферменты и регулятор ные пептиды. Процессинг этих белков осуществляется двумя вирусными ферментами, в том числе белков NS2/NS3 - с по мощью вирусной цинк-зависимой Ы82-3-протеиназы, осталь ных неструктурных белков - с помощью серин-протеиназы. Функции 3'-некодирующего региона на другом конце генома, в котором выделяют 3 участка, недостаточно изучены. Один из участков З'-некодирующего региона, обозначенный как "X tail" (98 нуклеотидов), является высококонсервативным и абсолют но необходимым для вирусной репликации.
Белки вируса и их функции. Соге-протеин - основной вирус ный структурный белок, обладающий РНК-связывающей ак тивностью, формирует нуклеокапсид вируса. Он вовлечен в це лый ряд клеточных процессов. Именно с соге-протеином связы вают выраженность прямого цитопатического эффекта HCV (см. главу 3). Показано, что соге-протеин модулирует транскрипцию и трансляцию некоторых клеточных генов, обладает онкогенным потенциалом в культуре клеток и на модели животных, может влиять на апоптоз (взаимодействие соге-протеина с рецептором В-лимфотоксина, с рецептором фактора некроза опухолиTNF1), а также модулировать контроль иммунной системы, опосредованный апоптозом лимфоцитов. Соге-протеин инги бирует транскрипцию вируса гепатита В [Shih С.М. et al., 1993] и репликацию вируса иммунодефицита человека [Srinivas R.V. et al., 1996].
El и E2 белки, посттрансляционно модифицирующиеся путем гликозилирования, являются основными гликопротеинами вирус ной оболочки. Эти белки высоковариабельны. С-концевые части белков оболочки вируса гидрофобны и могут принимать участие во взаимодействии с клеточной мембраной. Представляет ин терес идентификация на поверхности некоторых типов клеток, включая лимфоциты и гепатоциты, клеточного протеина (CD81), который может связывать Е2 [Pileri P. et al., 1998]. Полагают, что этот белок является рецептором или корецептором для HCV.
Неструктурный белок NS2 в совокупности с доменом NS3 является цинк-зависимой Ы82-3-протеиназой (ферментная ак тивность активизируется цинком и ингибируется хелаторами), осуществляющей разрезание NS2/NS3. Биохимическая структу ра этого фермента остается неизвестной, что усложняет задачу создания антивирусного агента, ингибирующего его функцию. Неструктурный белок NS3 многофункционален. Помимо части
32
Вирусы хронического гепатита
]ч1 5 2 -3 -цинк-зависимой протеиназы, NS3 содержит серин-про- теиназу, которая играет большую роль в заключительном этапе сборки вириона - разрезании неструктурных белков, и РНКзависимую нуклеотид-трифосфатазу/хеликазу, необходимую для вирусной репликации. NS4A-полипептид действует в качестве кофактора для NS3 серин-протеазы. Функции белка NS4B не изучены. Хотя функции белка NS5A в вирусной репликации неизвестны, имеется ряд доказательств, что этот белок играет роль в резистентности к интерферону-а. В NS85A выделен ре гион (аминокислоты 2209-2248), который участвует в ингиби ровании индуцируемой интерфероном-а протеинкиназы. Он был назван регионом, определяющим чувствительность к интерфе- рону-а ("interferon sensitivity determining region"). Показана раз личная чувствительность к интерферону-а в зависимости от мутаций в этом регионе [Enomoto N. et al., 1996; Gale M. et al., 1998]. NS5B является РНК-зависимой РНК-полимеразой - ферментом, необходимым для репликации HCV, осуществляю щим синтез вирусной РНК.
Расшифровка строения и дальнейшее изучение функций ви русных белков имеет большое значение как для понимания па тогенеза инфекции, так и для разработки подходов к ее лече нию. Так, высокая консервативность 5’- и З'-некодирующих регионов и их предполагаемая роль в трансляции и репликации вируса делают эти регионы предпочтительными мишенями в развитии генной терапии (противосмысловых олигонуклеотидов, рибозимов). Другим направлением в разработке новых проти вовирусных лекарственных препаратов является изучение струк туры вирусных ферментов (протеиназы, геликазы, РНК-зависи мой РНК-полимеразы) и создание ингибиторов их функций. И з учение генов, обусловливающих резистентность HCV к интер ферону (предполагается наличие других, помимо NS5A, генов), может помочь в повышении эффективности лечения интерфе роном.
Репликация HCV. Информация о репликации HCV до сих пор крайне ограничена. Известно, что HCV не продуцирует ДНК-промежуточных форм и геном его (в отличие от генома HBV) не способен к интеграции в геном клетки хозяина. Реп ликация осуществляется через синтез комплементарных про межуточных форм - цепей РНК с негативной полярностью, на основании которых синтезируются новые цепи РНК с пози тивной полярностью [De Francesco R., 1999]. Точные механиз-
Хронический вирусный гепатит
мы репликации HCV и участия в этом процессе РНК-зависи- мой РНК-полимеразы, а также других ферментов продолжают изучаться благодаря созданию в последние годы доступных экспериментальных моделей гепатита С "in vivo" и "in vitro". Экспериментальные трудности обнаружения цепи РНК с нега тивной полярностью обусловлены ее незначительным содержа нием в инфицированных клетках по сравнению с (+)цепью РНК, коротким периодом ее жизни, недостаточной специфич ностью цепной полимеразной реакции в варианте с обратной транскрипцией (возможность ложноположительных сигналов при детекции негативных цепей РНК). Тем не менее с по мощью разработанных в последние годы обладающих высокой специфичностью модификаций полимеразной цепной реакции, а также in situ гибридизации и методов обнаружения антигенов вируса в клетках доказана возможность репликации HCV не только в гепатоцитах, но и в периферических мононуклеарных клетках крови, в нейтрофилах, тромбоцитах, в клетках костно го мозга; получены также данные, не исключающие возмож ность репликации HCV в других органах и тканях (см. главу 3).
Гетерогенность HCV. Генотипическая классификация. Наи более важной характеристикой HCV является его выраженная гетерогенность, по степени которой HCV напоминает вирус иммунодефицита человека. Гетерогенность HCV, как и других РНК-содержащих вирусов, обусловлена особенностями репли кации вирусной РНК, которая не сопровождается коррекцией ошибок, а также высоким уровнем репродукции HCV. Показа но, что скорость продукции вирусных частиц составляет 10111012 в сутки с очень коротким периодом полужизни вирусных частиц (2,7-7,2 ч для HCV по сравнению с 26,4 ч для HBV) [Zeuzem S., 1999]. Вариабельность, т. е. подверженность мута циям, различных участков генома различна: наиболее консер вативными являются некодирующие регионы 5' и 3' (что по зволяет использовать 5'-некодирующий регион в диагностике с помощью полимеразной цепной реакции), в открытой рамке считывания - Core, наиболее вариабельными - Е1 и Е2 участки. У 5'-конца гена Е2 находится самый гетерогенный участок, кото рый был назван гипервариабельным регионом 1 (HNR1) [Hijikata М. et al., 1991; Weiner A.J. et al., 1991]. Установлено, что этот регион (около 90 нуклеотидов) кодирует HVR1 участок белка оболочки вируса (30 аминокислот - 390-420), содержа щий основные эпитопы-мишени для нейтрализующих антител
34
Вирусы хронического гепатита_______________________________________________________
rWeiner A.J. et al., 1992]. В E2 генотипа обнаружен еще один гипервариабельный регион [Hijikata М. et al., 1991], содержа щий около 21 нуклеотидов (HVR2), кодирующий участок белка оболочки вируса (аминокислоты - 474-480), значение которого
еще не установлено. |
|
4d |
||||
Изучение |
гетероген |
|
||||
ности нуклеотидных по |
|
|||||
следовательностей |
регио |
|
||||
нов Cor, Е1 и NS5 раз |
|
|||||
личных изолятов HCV, по |
|
|||||
лученных в разных регио |
|
|||||
нах мира, легло в основу |
|
|||||
генотипической |
класси |
|
||||
фикации |
HCV. Согласно |
|
||||
принятой |
|
в |
настоящее |
|
||
время номенклатуре, |
вы |
|
||||
деляют по |
крайней |
мере |
|
|||
6 больших |
групп |
(гено |
|
|||
типов), степень гомоло |
|
|||||
гии последовательностей |
Рис. 2 3 Филогенетическое дерево HCV, осно |
|||||
между которыми не пре |
ванное на анализе нуклеотидных последова |
|||||
вышает 70%. |
Внутри ге |
тельностей участка NS5B изолятов HCV, полу |
||||
нотипов |
выделяют |
под |
ченных в различных регионах мира: 6 основных |
|||
групп, соответствующих генотипам 1-6; каждая |
||||||
типы (описано более |
100), |
группа содержит подтипы; некоторые варианты, |
||||
характеризующиеся степе |
полученные в Юго-Восточной Азии, отнесены к |
|||||
нью гомологии от 70 до |
генотипам 3 и 6, но обозначены, как в оригиналь |
|||||
85% (рис |
2.3) |
[Simmonds |
ных публикациях (по Р Е.Simmonds, 1999). |
|||
|
Р.Е., 1999]. До настоящего времени существуют трудности в классификации вариантов HCV, полученных в Юго-Восточной Азии (Таиланд, Вьетнам, Индонезия) и описанных авторами как генотипы 7-11. Однако филогенетический анализ этих ва риантов, по мнению ряда авторов, позволяет рассматривать их как подтипы внутри генотипов 3 и 6, несмотря на то что сте пень гомологии между ними значительно меньше, чем между
подтипами, относящимися к другим генотипам [Simmonds Р.Е., 1999].
Генотипы HCV с различной частотой встречаются в разных регионах мира. Основные генотипы - 1, 2, 3 (особенно их под типы la, lb, 2а, 2Ь, За) - широко распространены в мире, пре имущественно в Америке, Западной Европе, на Дальнем Во стоке (с преобладанием 1а в Северной Америке и на севере
35
Хронический вирусный гепатит
Европы, в то время как lb - в Японии, на юге и востоке Евро пы). Генотип 4 распространен в Центральной Африке и Сред нем Востоке (является основным генотипом в Заире, Египте). Генотип 5 преобладает на юге Африки, генотип 6 с его мно жеством вариантов - в Юго-Восточной Азии [Bukh J. et al., 1995]. В России преобладает генотип lb, который составлял в различных регионах от 50 до 83% всех изолятов [Львов Д.К. и др., 1997]. Причины географических различий в распределении генотипов не совсем ясны. Предполагается связь с путями ин фицирования [Pawlotsky J.M . et al., 1995]. Однако поскольку филогенетический анализ РНК вируса позволил предположить, что образование основных генотипов HCV произошло 500-2000 лет назад [Smith D.B. et al., 1997], а основные парентеральные механизмы передачи вируса появились относительно недавно, не ясны пути инфицирования вирусом на протяжении многих столетий.
Наличие в сыворотке крови больного вирионов, относящихся к двум или более генотипам HCV, наблюдается редко. Показано, что HCV присутствует в организме хозяина в виде гетероген ной популяции близких генетически вирионов - квазивидов [Martell М. et al., 1992], степень гомологии между последова тельностями основных консервативных регионов которых до стигает 98-100%, но существуют различия, обусловленные то чечными мутациями преимущественно в HVR1 генома. Среди квазивидов обычно определяется доминирующий и различное количество подчиненных. На протяжении хронической ин фекции происходят быстрые мутации, ведущие к смене домини рующего квазивида, избеганию иммунного ответа [Weiner A.J. et al., 1992; Bukh J. et al., 1995].
2.4. ВИРУСЫ ГЕПАТИТА G И TT
HGV, гак же как GBV-A, GBV-B, GBV-C и HCV, относят к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепо чечной РНК с позитивной полярностью, по своей организа ции подобен РНК HCV, т.е. структурные гены расположены у 5'-области генома, а неструктурные - у З'-конца (см. далее рис. 2.4). Установлено, что HGV-С и HGV имеют высокую гомологичность (86% на уровне нуклеотидов и 95% на уров не аминокислот), что позволяет рассматривать их как вариан ты одного и того же вируса, для обозначения которого ис пользуется термин "HGV".
36
Вирусы хронического гепатита
В качестве маркера для диагностики и изучения эпидемиогепатита G служит PHK-HBV-C/HGV, выявляемая мето- Л°м обратной транскрипции (RT-PCR), при которой синтези-
Д°ется кДНК. Антитела GBV-C/HGV (к оболочечному антиге- V Е2) выявляются у больных гепатитом и здоровых лиц, как правило, в отсутствие PHK-GBV-C/HGV, в связи с чем этот тест не может быть использован как диагностический. В то же время он сохраняет значение для регистрации уже прошедшей инфекции и проведения эпидемиологических исследований
[Михайлов М.И., 1997, Kiyosawa Т., Tanaka Е., 1999].
Вэпидемиологическом отношении гепатит G, как и гепати ты В и С, относится к инфекциям с парентеральным путем пе редачи, и источником распространения вируса являются боль ные острым или хроническим гепатитом G и носители HGV. Вирус можно обнаружить в сыворотке, плазме, мононуклеарных клетках периферической крови [Medejon A. et al., 1996] и слюне [Fabris P. et al., 1997]. Парентеральный механизм зара жения может реализоваться при использовании контаминированных кровью шприцев, о чем свидетельствует чрезвычайно вы сокое (88,9%) распространение гепатита G среди инъекционных наркоманов. Возможен половой путь заражения. Доказано от сутствие вертикального пути передачи.
ВРоссии частота выявления РНК GBV-C колеблется от 2%
вМоскве до 8% в Якутии [Михайлов М.И., 1997]. В регионах мира с высоким распространением гепатитов В и С опреде ляется более высокий уровень гепатита G и больший процент лиц-носителей HGV по сравнению с HCV и HBV.
H G V РНК в сыворотке крови выявляется у больных острым вирусным гепатитом (в том числе фульминантным), хрониче ским гепатитом, чаще в сочетании с маркерами других вирусов. Случаи моноинфекции наблюдаются редко. Наибольшая часто та выявления HGV РНК отмечается при посттрансфузионном гепатите. Обращается внимание на низкую частоту обнаруже ния HGV РНК при гепатоцеллюлярной карциноме. Не доказа
на роль HGV в развитии апластической анемии. Установлено,
что этот вирус не является главной причиной аутоиммунного гепатита.
При изучении HGV-инфекции отмечена малая (мягкая) па тогенность этого вируса (в том числе у половины инфицироанных - нормальные показатели аминотрансфераз), что при вело к сомнению по поводу гепатотропности HGV. Главными
37