18 Рост микроорганизмов. Влияние внешних факторов на рост микроорганизмов. Методы обнаружения и выделения микроорганизмов.

Рост микробной клетки – это увеличение размера и массы одной особи между двумя делениями. В результате обменных процессов с окружающей средой и внутриклеточного метаболизма происходит рост и развитие организма. Конечная цель развития м/организма - размножение. Под ростом подразумевается не только рост отдельной клетки, но и большее увеличение числа клеток в результате размножения, т.е. рост культуры микроорганизмов.

Культура представляет собой совокупность особей, которое занимает определенное жизненное пространство.

Культуру называют чистой, если она представлена м/организиами одного вида. Культуру, в которой содержится более чем один вид микробов, называют смешанной или гетерогенной.

Рост микроорганизмов зависит в первую очередь от наличия воды: грибы способны расти на субстрате, содержащий 12% воды, бактериям требуется для роста более 20%. В питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых строится клетка, и в такой форме, которую микроорганизм способен усваивать. В больших количествах необходимы макроэлементы: сера, фосфор, кислород и микроэлементы: цинк, никель, молибден и др.

Для роста м/организмов требуется и ряд дополнительных условий. Микроорганизмы нуждаются:

– в определенных концентрациях некоторых хим. веществ, особенно водородных ионов;– в совершенно определенном соотношении разных ионов;– в поддержании определенного окислительно-восстановительного потенциала среды.

Некоторые требовательные м/организмы и мутанты нуждаются, кроме того, в отдельных соединениях, которые сами синтезировать не могут. Такие необходимые дополнительные вещества называют факторами роста, их роль могут играть аминокислоты, витамины, пурины.

Влияние внешних условий на рост м/орг. И условия роста

При удовлетворении всех потребностей в питательных веществах рост м/организмов зависит от определенных условий:

– концентрации водородных ионов;– температуры;– осмотического давления.

Решающее значение для роста м/организмов имеет рН среды. Большинство м/организмов лучше растет, когда концентрации Н ОН одинаковы (рН - 7,0). Грибы предпочитают более низкие значения рН.

К температуре различные микроорганизмы относятся по-разному. Большинство почвенных и водных бактерий лучше растут от 20 до 45º С – мезофилы. А спорообразующие бактерии лучше растут при температуре выше 45º С – термофильные. Другую крайность представляют психрофильные бактерии, которые растут при температуре ниже 20º С (железобактерии). Термотолерантными называют бактерии, которые могут расти в области средних температур, но могут переносить и более высокие температуры (мин-37º С, мах-50º С).

К осмотическому давлению питательной среды большинство бактерий проявляет большую устойчивость. Многие бактерии могут расти на средах с содержанием солей от 0,1 до 10%.

Всем аэробным бактериям в качестве акцептора необходим кислород. Для бактерий, которые растут в тонких слоях жидкости в присутствии воздуха кислорода достаточно. В жидких средах при большом объеме жидкости аэробные бактерии могут расти только на поверхности. Для этого требуется аэрация. М/организмы способны использовать только растворенный кислород.

Для роста строго анаэробных бактерий исключается доступ кислорода воздуха. В технике применяют: прокипяченные, лишенные воздуха питательные Среды, закрытые без пузырьков сосуды, применение различных веществ, поглощающих кислород и др.

Экспонциальный рост и время генерации.

Бактерии размножаются делением надвое и, следовательно, их число растет в геометрической прогрессии: 2⁰-2¹-2²-2ⁿ . Если на единицу объема растущей ст. культуры приходится N₀ клеток, то после n делений число клеток будет N=N₀ 2ⁿ. Логарифмируя, получаем Lg N=lg N₀+ nlg 2, откуда число клеточных делений:

Число клеточных делений за 1 час- константа скорости деления U определяется:

Время, требующееся для одного цикла делений, отсюда время генерации равно:

Если за 10 часов число клеток в суспензии возрастает с 10³ до 10⁹, константа деления равна

время генерации равно 1/2 часа.

Отложив по оси ординат число клеток в экспоненциально растущей популяции, а по оси абсцисс время, получим экспоненциальную кривую роста.Рост бактерий в статической культуре. Кривая роста.

При внесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов Среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении всего времени не прибавлять питательных веществ и не удалять продуктов обмена, то получится статическая бактериальная культура.

Кривая, которая описывает зависимость логарифмов числа клеток от времени – называется кривой роста. Кривая роста имеет S-образную форму. Различают несколько фаз роста, которые сменяют друг друга в определенной последовательности.

Рис. .акономерности роста статической культуры

1 – рост культуры во времени, 2 – кривая потребления субстрата

Начальная фаза (лаг фаза) охватывает промежуток времени между началом роста и достижением максимальной скорости роста. Продолжительность этой фазы зависит от предварительного культивирования, от возраста м/организма, и на сколько пригодна для роста данная питательная Среда.

Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость деления во время этой фазы зависит от вида бактерий и от Среды. Одни представители делятся через каждые 15 мин. при температуре 37º С, другие 6-150 мин., даже 5-10 часов. Величина клеток и содержание белка в клетках остаются постоянными.

Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата. Поэтому при уменьшении этой концентрации. Наблюдается снижение скорости роста, Переход от экспоненциальной к стационарной фазе роста происходит постепенно. Скорость роста может снижаться и за счет большой плотности бактериальной популяции или из-за накопления токсичных продуктов обмена. В стационарной фазе могут происходить такие процессы, как использование запасных веществ, синтез ферментов, быстро гибнут очень чувствительные клетки. Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем.

Рост в непрерывной культуре.

В статической культуре условия все время изменяются: плотность популяции бактерий увеличивается, а концентрация субстрата уменьшается.

Для многих физиологических исследований представляется дать возможность клеткам длительное время находится в фазе экспоненциального роста при постоянной концентрации субстрата и неизменных прочих условиях.

Добиться того положения можно, многократно перенося клетки на новую питательную среду. Той же цели можно добиться, если в сосуд, содержащий популяцию растущих клеток, непрерывно вводить новый питательный раствор и одновременно удалять из него соответствующее количество бактериальной суспензии. Такой метод положен в основу непрерывного культивирования в хемостатах и турбидостатах.

Хемостат состоит из сосуда-культиватора, в который из особого резервуара поступает с постоянной скоростью питательный раствор. Благодаря аэрации и механическому перемешиванию в культиваторе создаются оптимальные условия для снабжения кислородом и быстрого распределения питательных веществ. По мере поступления в сосуд питательного раствора из сосуда вытекает бактериальная суспензия.

Работа турбидостата основывается на поддержании постоянной плотности бактериальной суспензии или постоянной мутности. Фотоэлемент, который измеряет мутность, регулирует через систему реле поступление питательного раствора. В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, и скорость роста бактерий приближается к максимальной.

Основные различия между статической и непрерывной культурой.

1. Статическую культуру можно рассматривать как закрытую систему, которая в своем развитии проходит все фазы роста. Каждый из этих периодов характеризуется определенными условиями. Автоматическое регулирование в статической культуре невозможно.

2. Непрерывная культура представляет собой открытую систему, которая стремится к равновесию.

20. Объекты и методы биотехнологии. Основные стадии биотехнологического процесса:. предферментация, ферментация, постферментация. Подразделение биотехнологических процессов. Обезвреживание и утилизация отходов биотехнологических производств.

. Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы, клетки растений, животных и человека, биогенные вещества. Диапазоны распространяются от вирусов до человека. Для реализации биотехнологических процессов важными параметрами биообъектов являются: чистка, скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул. Независимо от систематического положения биообъекта, на практике используют либо природные организованные частицы (фаги, вирусы) и клетки с естественной генетической информацией, либо клетки с искусственно заданной генетической информацией.

Биотехнологические процессы подразделяются на биологические, биохимические, биоаналогичные. К первым относят те из них, которые основываются на использовании акариот, прокариот, вторые - на использовании ферментов, третьи - на химическом синтезе.

Многие процессы биологической технологии являются общими (показательно на аппаратурном направлении, на выборе биореакторов).

Специальные - которые имеют свои специфические особенности (т.к. выращивание пеницилина, культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах). С учетом этого все биотехнологические процессы делятся на микробиологические, фито- зообиотехнология.

По условиям проведения процесса различают нестерильные (крупнотонажное производство кормовых дрожжей) и стерильные (получение антибиотиков, витаминов): аэробные и анаэробные.

Процессы проводят в одном из 3 режимов:

• периодическое

• полунепрерывное;

• непрерывное.

При периодическом режиме процесс проводят от начала до конца по регламенту, после завершения всех операций его повторяют.

При полунепрерывном режиме осуществляется отливно-доливной процесс, когда на "пике" биосинтеза какого-либо антибиотика отбирают 30-70% культуральной жидкости и одновременно (однократно) добавляют свежей питательной среды.

При непрерывном режиме процессы рассчитаны на непрерывный отбор культуральной жидкости и непрерывное добавление свежей питательной среды.

основные стадии: предферментация, ферментация, постферментация

Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники органического углерода (субстраты) начиная от простейших углеродных соединений, таких как метан (СН₄), метанол (СНзОН) и кончая природными био­полимерами.

Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста нуждаются в источниках азота, фосфора, макро- и микроэлементов . Питательные среды готовят в Отделение приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, сред­ствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройст­вами Важнейшим элементом подготовки питательных сред является их сте­рилизация, это достигается путем предварительной стери­лизации всех потоков, поступающих на стадию ферментации.Для стерилизации газовых потоков используют фильтрацию через спе­циальные волокнистые фильтры с определенным диаметром пор, которые задерживают клетки микроорганизмов из окружающей среды.

Все потоки могут стерилизоваться термическим, радиационным, фильтрационным или химическим методами.

Основой любого биотехнологического производства является штамм-продуцент целевого продукта., который можето сохранить на протя­жении длительного времени полезные свойства .На предприятие в условиях собственной центрально-заводской лаборатории обновляет культуру пу­тем периодических пересевов на специально подготовленной среде и в дальнейшем организует ее хранение в холодильнике при температуре 3-4°С. Проходит микробиологический контроль прежде всего проверяют чистоту культуры, а иногда и наличие типичных цитологических признаков. Присутствие хотя бы одной посто­ронней колонии в высеве с данной партии посевного материала выбрако­вывает всю партию.

Количество засевного материала, передаваемого в основной ферментер, может варьировать в разных производствах от 5 до 20% объе­ма среды культивирования в нем, то накопление производственной куль­туры проводят 2-6 этапов.

Основная ферментация

Процесс ферментации может осуществляться 2-мя способами: поверхностного культивирования, когда выращивание производствен­ной культуры производят на среде, содержащей

твердые частицы субстра­та; 2) глубинного культивирования, когда выращивание той же культуры микроорганизмов происходит во всем объеме жидкой питательной среды, содержащей растворенный субстрат.

При поверхностном способе культивирование проводится в так назы­ваемых кюветах.,,, ,

Более распространенным в микробиологической промышленности яв­ляется метод глубинного культивирования . По сравнению с поверхност­ным способом он является более интенсивным, позволяет вырабатывать за единицу времени и объема большее количество целевого продукта. глубинное культивирование проводят в емкостных аппаратах, которые назы­ваются ферментаторами или ферментерами (рис.2). Такой аппарат должен обеспечивать: 1) рост и развитие популяций микроорганизмов в объеме жидкой фазы, 2) подвод питательных веществ к клеткам микроорганиз­мов, 3) отвод от микробных клеток продуктов их обмена веществ (метабо­лизма), .4) отвод из среды выделяемого клетками тепла.

В зависимости от цели биотехнологического производства - получение клеток или продуктов их жизнедеятельности - способы ведения основной ферментации несколько различаются. Если процесс направлен на получение биомассы, то назначение ферментации - получить максимально воз­можный титр клеток, а в случае получения метаболитов их накопление осуществляют одновременно, причем максимумы образования продуцента и целевого продукта всегда сдвинуты по времени. Поэтому продолжи­тельность ферментации в первом случае всегда меньше, чем во втором.

Ферментационные процессы отличаются и значениями контролируе­мых параметров. К ним, прежде всего, относятся температура, рН среды, объемный расход воздуха. При культивировании различных микробных клеток интервал рабочих температур варьирует от 25 до 60°С, значения рН - от 2 до 9, расход воздуха в аэробных процессах - от 0.15 до 2.5 м° на 1 м' среды в минуту. Весьма важна точность, с которой эти параметры под­держиваются в ходе проведения отдельной ферментации. Температуру стараются поддерживать с точностью 1°С, рН среды - 0.2, объемный рас­ход воздуха -10%. Продолжительность проведения отдельных фермента­ции тоже сильно варьирует. Если целью является получение биомассы промышленного штамма в периодическом процессе, то время культивиро­вания в периодическом процессе не превышает 24 ч. При производстве первичных метаболитов время биосинтеза составляет уже 48-72 ч, а вто­ричных - более 72-144 ч.

Технологическое оформление процессов биосинтеза различается также в зависимости от отношения организма-продуцента к кислороду. С этой точки зрения различают аэробные и анаэробные процессы.

Большинство используемых в современном производстве культур мик­роорганизмов являются аэробными, т.е. требуют присутствия кислорода в среде. Это достигается путем обеспечения необходимой концентрации растворенного кислорода в жидкой питательной среде.

По окончании ферментации культуральная жидкость поступает на пе­реработку, где происходит выделение и очистка целевого продукта.

Выделить целевой продукт можно методм: фильтрования, сепарирования или концентрирования на бактофугах, использование барабанных вакуум-фильтров, методом осаждения, методом ультрафильтрации.

Последней стадией технологического цикла в микробиологическом синтезе является получение товарной формы продукта. В зависимости от принятых на предыдущей стадии решений, товарные формы представляют собой либо сложную смесь, содержащую среди прочих некоторое количество основного вещества, определяемое техническими условиями или ГОСТ, либо достаточно высоко очищенный препарат.

Стадия фасовки препаратов кормового и технического назначения заключается в помещении их в тару, размеры и тип которой определяются потребностями заказчика и свойствами продукта.

Отходы биотехнологических производств относятся к типу разлагающихся в природных условиях

Отходы биотехнологических производств подразделяются на твердые и жидкие и газообрзные..

Твердые отходы либо ожигают (перептобельно) либо передают на биологическое обезвреживание. Если отходом является биомасса клеток например стрептомицетов, их достаточно убить нагревом, далее их можно уже использовать в качестве добавок к кормам, в качестве удобрений. В аэробных очистных сооружениях, где происходит обезвреживание отходов, лимитирующими факторами выступают качество и площадь биопленки, состоящий из микро-макрофлоры и фауны.

Жидкие отходы мгут подвергаються микробиологической обработке.

"Отработанный воздух" биотехнологических процессов не должен поступать в атмосферу без очистки и обезвреживания, должен быть термически обработан и только после этого подвергаегся фильтрационной очистке.