книги / Экспериментальные методы в биомеханике
..pdfVV |
= AA = LL = PP , |
(7.1) |
|||
SV |
= |
4 |
BA = 2I L , |
(7.2) |
|
π |
|||||
|
|
|
|
||
|
MV |
= 2QA . |
(7.3) |
||
Первое равенство соотношения (7.1), известное как принцип Делесса, было эмпирически получено в 1847 году французским геологом Delesse, а затем строго доказано многими стереологами, на-
пример Smith и Guttam (1953), Weibel (1963) и Underwood (1967) [18, 68]. Второе равенство соотношения (7.1) было эмпирически получено в 1898 году Rosiwal; третье равенство – русским геологом Глагольевым в 1933 году. Первое равенство соотношения (7.2) было получено в 1958 году Салтыковым (и записано в виде BA = Λ·SV); второе равенство соотношения (7.2) и соотношение (7.3) – незави-
симо Smith и Guttam (1953) и Салтыковым (1958) [68].
Впервые к проблеме описания анизотропии зернистых материалов обратился русский ученый Салтыков в книге «Стереологическая металлография» (1958) [18]. Салтыков заметил, что число пересечений секущей прямой с граничными поверхностями на единице ее длины показывает плотность расположения этих поверхностей в направлении ориентации секущей. Автор предположил, что анизотропия свойств металлов и сплавов определяется изменением плотности граничных поверхностей в зависимости от направления. Наиболее наглядную характеристику изменения плотности расположения граничных поверхностей в зависимости от направления даёт «роза числа пересечений m», которая показывает число пересечений на единице длины секущей прямой для ее любого наплавления на плоскости шлифа или в пространстве.
Экспериментальное построение «розы числа пересечений» для плоскости шлифа производится следующим образом. На шлифе (микрофотографии) проводят группу параллельных секущих, образующих определенный угол β с заранее выбранной осью отсчета, с осью ориентации элементов структуры, например, если ее направление определяется простым визуальным наблюдением. Определив
251
среднее число пересечений в данном направлении, mβ, в [мм–1 ], проводят следующую группу секущих, но уже в другом направлении, и т.д. Получив ряд средних чисел пересечений для многих, желательно равноотстоящих друг от друга направлений, на плоскости строится «роза числа пересечений» в полярной системе координат. Полученная «роза» являлась ориентационной характеристикой граничных поверхностей. Эта «роза» была единственной окружностью для изотропного образца, состояла из двух равных окружностей, касающихся друг друга, если образцы состояли из полностью ориентированных структур, и имела гантелевидную форму для многих реальных частично ориентированных структур. В дальнейшем идеи Салтыкова были детализированы Underwood (1970) [66, 70].
Hilliard (1962) и позже Philofsky и Hilliard (1969) предложили определять анизотропию внутренней структуры материалов функциями распределения, которые определяют то, какая часть полной длины линий границы, замеченных на плоскости, лежат в данном направлении. Они предложили это исследовать путём подсчёта числа пересечений между границей и сеткой тестовых линий
[66, 70].
Метод, предложенный Hilliard [46] был более общим, чем метод Салтыкова. Данный метод использует поверхностные плотно-
сти. |
Hilliard |
вводит |
в рассмотрение |
функцию распределения |
|||
S (ϕ , ψ |
) , которая |
определена как |
доля |
площади поверхности |
|||
в единичном |
объеме, |
имеющая |
вектор |
единичной нормали |
|||
в диапазоне ϕ |
± dϕ |
и ψ |
± dψ (где φ и ψ – |
полярные и плоские углы |
|||
всферических координатах). Полная площадь поверхности задавалась простым интегрированием функции S (ϕ , ψ ) по единичной сфере. Некоторые довольно сложные математические преобразования позволяли получить выражение для поверхностной плотности
втерминах измерения пересечений. Для измерений в плоскости, чья
нормаль ϕ = (π / 2) , функция S (ϕ , ψ |
) принимала следующий вид: |
||
S (π / 2,ψ |
) = (1/ π ) × |
(7.4) |
|
× {[(Р(ω + ∆ ω ) − 2Р(ω ) + |
Р(ω − ∆ ω ) /(∆ ω |
||
2 )]+ Р(ω )}, |
|||
252
где ∆ ω – приращение угла между последовательными измерениями и ω = ψ + π / 2 . Заметим, что это дает оценку функции S (ϕ , ψ ) для
ϕ = (π / 2) .
Данный метод был использован Flinn и Philofsky (1968) в металлографической задаче, которая имела много общего с исследованием трабекулярной костной ткани [70]. Измерение структурной анизотропии биологических материалов методами количественной стереологии впервые было рассмотрено Hillard (1967) [45, 47]. Позднее методами количественной стереологии при решении ряда цитологических задач широко пользовался Weibel [68].
В 1970 году Merz в работе [54] предложил исследовать биологические объекты, в частности костную ткань, посредством специально сконструированной сетки. Данная сетка накладывалась на поверхность исследуемого шлифа. Она состояла из комбинации точечной сетки, предназначенной для оценки площади, и сетки, состоящей из линий, предназначенной для оценки линейных размеров. Однако данная сетка не часто используется при стереологических исследованиях. Для оценки стереологических параметров чаще используют две отдельные сетки: точечную для оценки площади образца и состоящую из параллельных линий для оценки линейных параметров (рис. 7.7). Данные сетки были использованы, например Lloyd [51] и Whitehouse [70], для исследования трабекулярной кости: оценки пористости кости и ее преимущественной ориентации.
В настоящее время существует ряд специальных величин, позволяющих описывать структуру губчатой костной ткани. Прежде всего, это метод, предложенный в серии работ [39, 45, 70, 72], а именно, метод среднего расстояния между порами (the mean intercept length method). Данный метод будет рассмотрен подробно ниже. Также необходимо упомянуть о методе ориентации объема
(the volume orientation method) и о методе распределения «звезд» по объему (the star volume distribution method) [36]. Иллюстрация дан-
ных методов показана на рис. 7.8.
Исследования структуры губчатой кости методами количественной стереологии были проведены Whitehouse [70] (см. также [69, 71–74]). Далее будут изложены основные идеи, использованные Whitehouse в своих исследованиях [70].
253
Рис. 7.7. Точечная сетка, предназначенная для оценки площади образца (а), и сетка, состоящая из параллельных линий, для оценки линейных параметров (б) [39]
Были рассмотрены девять электронных микрофотографий, на которых были проведены измерения (рис. 7.9). В качестве образцов использовались шлифы трабекулярной костной ткани из тела поясничного позвонка и из двух головок бедренной кости; все образцы были получены от молодых внезапно умерших взрослых людей, не имеющих никаких признаков заболевания костного мозга или костной ткани. Степень увеличения микрофотографий шлифов костной ткани варьировалась примерно в пределах от ×15 до ×50 [70].
Рис. 7.8. Двухмерная иллюстрация методов определения структуры губчатой костной ткани [56]
254
Рис. 7.9. Пример микрофотографии и обработанных изображений, используемых для стереологических исследований [70]
Автор отмечал [70, 74], что иссечение шлифов кости не было точной операцией, поскольку методы ее последующей обработки (например, шлифования поверхности костного образца) требовали, чтобы кость сохранялась в замороженном состоянии с момента ее иссечения. На образце всегда оставалась мягкая ткань, плотно прилегающая к кости, поэтому было невозможно провести точные анатомические наблюдения.
Непосредственные стереологические измерения производились на электронных микрофотографиях, на которых была запечатлена структура в исследуемых образцах трабекулярной костной ткани (рис. 7.10). Как будет показано ниже, для исследования было необходимо определить площади и длины периметров костных областей. Площади были измерены на микрофотографиях с использова-
255
нием ранее упомянутых точечных сеток [39], а периметры – путем подсчета числа пересечений, сделанных сетками, состоящими из параллельных линий, с элементами костной структуры. Во втором случае было использовано три сетки, отстоящие друг от друга на угол, равный 120°, что эффективно устраняло накопление погрешностей благодаря необходимой произвольной ориентации данного образца.
Рис. 7.10. Обработанные фотографии структур губчатой кости, полученные: от (а) сагиттального сечения тела поясничного позвонка; (б) венечного сечения головки бедренной кости; (в) поперечного сечения головки бедренной кости; (г) венечного сечения головки бедренной кости рядом с кортикальной костью [70]
Отвлекаясь от исследования Whitehouse [70], следует отметить, что для многих морфологических исследований препараты (шлифы кости) изготавливаются из целого ряда образцов. В таком случае
256
в принципе не существует никаких ограничений в количестве доступной стереологической информации. При этом главный источник статистических колебаний связан с различиями между разными костными образцами. Однако бывают ситуации, когда количество исходного костного материала строго ограничено. В этом случае критерии случайности и единообразия применимы только к областям, которые были малы по отношению ко всему исходному трабекулярному образцу. Это является главной причиной неточности количественных результатов при стереологических исследованиях [74].
Микроснимки шлифов костной ткани с предварительно удалённым костномозговым веществом, как правило, дают четкое визуальное представление о трехмерной структуре. В то же время измерения на шлифах при использовании сеток, состоящих из точек, или сеток, состоящих из параллельных линий, (либо их электронных эквивалентов), делают возможным получить некоторую количественную информацию, которая и была получена с поверхности образцов.
Как говорилось выше, в работе [70] было проведено измерение относительной площади кости на поверхности шлифа. Данная величина, обозначенная как AAb имела размерность [мм2 / мм2]. (Соответственно относительная площадь поры на поверхности шлифа обозначалась как AAm и вычислялась как AAm = 1 − AAb .)
Другая измеренная величина – это длина проекции периметра границы на единицу площади поверхности образца. Проектирование проводилось в направлении под углом ω (здесь и далее используются авторские обозначения) к некоторому направлению, выбранному в качестве начального. Из рис. 7.11 видно, что граница проецируется на прямую, проходящую под углом ω + 90°. Проекция границы, приходящаяся на единицу площади поверхности образца, была обозначена как JA(ω), она измеряется в [мм / мм2]. Для примера, представленного на рис. 7.11, общая длина проекции периметра под углом ω была равна 2а + 2b , а проекция границы на единицу пло-
щади J A (ω ) = 2(a + b) / l 2 соответственно. Среднее арифметическое граничной проекции для ω [0, π] на единицу площади было обозначено как J A и имело размерность [мм / мм2].
257
Рис. 7.11. Нахождение общей длины проекции периметра границы простого полого овала, лежащего в квадрате со стороной l [70]
Отметим, что полная длина границы между костью и костным мозгом на единицу площади поверхности образца, обозначенная BA и измеряемая в [мм / мм2], может быть вычислена как
|
|
|
|
π |
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
BA = |
|
|
|
|
|
|
J A |
|
|
|
(7.5) |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|||||||||
– |
общепризнанный стереологический результат. |
|
|||||||||||||||
Среднее расстояние между порами вычислялось по следую- |
|||||||||||||||||
щей формуле |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Lb (ω ) = |
|
|
|
|
|
|
AAb |
|
|
|
(7.6) |
|||||
|
|
|
1 |
|
J A (ω |
) |
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|||||||||
– |
для кости, и по формуле |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Lm (ω |
) |
= |
|
|
|
|
|
|
AAm |
|
|
|
(7.7) |
|||
|
|
|
|
1 |
J A (ω |
) |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|||||||
258 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
– для поры. Среднее расстояние между порами имело размерность [мм]. Отметим, что в стереологии среднее расстояние между порами является одной из основных величин, с помощью которых описывают степень анизотропии материала. Согласно классическому определению Underwood [66] среднее расстояние между порами – это «среднее расстояние между двумя границами кость– пора, измеряемое вдоль определенного направления». Подробнее данный стереометрический параметр будет рассмотрен далее.
Также в работе [70] определялась величина W – средняя ширина трабекул, измеряемая в [мм] по следующей формуле:
W = |
2 AA |
. |
(7.8) |
|
|||
|
BA |
|
|
Не существует строгого доказательства того факта, что функция JA(ω) описывается какой-либо кривой. Однако можно показать, что измеренные значения JA(ω) могут быть аппроксимированы синусоидой или, что то же самое, эллиптической кривой в полярной системе координат. Эмпирическая формула для JA(ω) имеет следующий вид:
[ J A (ω )]2 = α + β cos 2ω + γ sin 2ω , |
(7.9) |
где коэффициенты α, β и γ могут быть найдены из решения системы уравнений (7.9), полученной после трех экспериментальных изме-
рений JA(ω).
Формула (7.9) эквивалентна (7.10)
[ J A (ω )]2 = α |
+ c cos 2(ω − δ ), |
(7.10) |
||||
если ввести следующие обозначения |
|
|||||
|
|
A = α 12 , |
(7.11) |
|||
J |
||||||
с2 = β 2 |
+ γ 2 , |
(7.12) |
||||
tan 2δ |
= |
γ |
. |
(7.13) |
||
|
||||||
|
|
|
|
β |
|
|
259
Очевидно, что графиком уравнения (7.10) являлась косинусоида. На рис. 7.12 показаны графики, полученные в работе [70] из уравнения (7.10) и эмпирически полученные точки средних расстояний между порами. Видна высокая степень соответствия теоретических и экспериментальных данных.
Рис. 7.12. Сравнение эмпирически и теоретически полученных зависимостей [JA(ω)]2 [70]
Уравнение (7.10) имеет ту же самую форму, что и уравнение (7.18) (см. разд. 7.3), которое является формой записи уравнения эллипса. Таким образом, в полярной системе координат зависимость JA(ω) может быть описана уравнением эллипса, а величина, обратная JA(ω), будет радиусом-вектором полученного эллипса. На основании формул (7.6) и (7.7) радиусы-векторы станут величинами средних расстояний между порами Lb(ω) и Lm(ω) (рис. 7.13).
260