книги / Экспериментальные методы в биомеханике

Список литературы к главе 5

1.Белкин И.М. Ротационные приборы. Измерение вязкости

ифизико-механических характеристик материалов / И.М. Белкин, Г.В. Виноградов, А.Я. Леонов. – М.: Машиностроение, 1968.

2.Виноградов Г.В. Реология полимеров / Г.В. Виноградов, А.Я. Малкин – М.: Химия, 1977.

3.Механика кровообращения / П. Каро [и др.]. – М.: Мир, 1981.

4.Чанг Дей Хан. Реология в процессах переработки полимеров / Чанг Дей Хан. – М.: Химия, 1979.

5.Шрамм Г. Основы практической реологии и реометрии / Г. Шрамм. – М.: КолосС, 2003.

181

Глава 6 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ БИОМЕХАНИКИ

КОСТНОЙ ТКАНИ

6.1. Виды и состав костной ткани

Костная ткань при рассмотрении с разрешением до 0,1 мм бывает двух видов, различающихся своей пористостью (отношением суммарного объема пор в образце к объему образца). Пусть V – полный объем некоторой области кости. В предположении, что костная ткань является двухкомпонентным биокомпозитом [30], этот объем может быть разделен на две части: жесткий костный матрикс Vм и пустоты Vп, заполненные мягкой тканью. Тогда

Величины ξ м и р являются основными скалярными характеристиками структуры костной ткани. Очевидно, что

Если ρ − физическая плотность костной ткани, а ρ ж − плотность мягких тканей в пустотах, то в соответствии с правилом смеси для многокомпонентных сред [14] получим равенство

Хотя в принципе пористость кости может изменяться непрерывно от нуля до 100 %, на самом деле большинство костных тканей

____________

1 В зарубежной литературе, говоря о кости, часто используют сокращение

BVF – Вone Volume Fraction.

182

тях (например, в позвонках), в плоских костях и на концах длинных костей (рис. 6.1); ее пористость составляет 55–85 %.

Поры связаны между собой и заполнены костным мозгом. Костный матрикс имеет форму пластин или распорок, называемых трабекулами, толщиной примерно 200 мкм каждая. Расположение трабекул бывает различным. Иногда они организуют структуру с ортогональной симметрией, но часто расположены беспорядочно. Математическое описание преимущественной ориентации трабекул приводится в гл. 7.

Компактная кость — это плотная кость, находящаяся в стволах длинных костей и формирующая кортекс, или оболочку вокруг тел позвонков и других губчатых костей (рис. 6.2). Поэтому ее называют также кортикальной костью. Пористость кортикальной кости составляет 5–10 %, и ее поры разделяются на следующие категории:

Гаверсовы каналы2 (см. рис. 6.2) расположены приблизительно вдоль длинной оси кости, содержат капилляры, внутритканевую жидкость; в некоторых каналах проходят нервы. Их диаметр равен примерно 50 мкм (порядка диаметра человеческого волоса), длина остеона в среднем равна 2,5 мм.

____________

2 Гаверсовы каналы названы в честь английского врача Клоптона Гаверса

(1650–1702).

183

собой стержни или пластины с гексагональной симметрией и имеют размер примерно 50× 50× 400 ангстремов (1 микрометр [мкм] = = 10 000 ангстремов [Ǻ]). Минерал кости не является химически чистым, он содержит много примесей (карбонаты, фториды, соли лимонной кислоты), которые зависят от состава жидкостей в теле

ивлияют на растворимость минерала кости.

Косновным количественным характеристикам состава костной ткани относятся процентные содержания кальция, фосфора, воды, физическая плотность, доля золы и минерализация. Последняя характеристика применяется в клиниках при компьютерном анализе рентгенограмм с целью диагностики остеопороза (заболевание костной ткани, проявляющееся в потере минеральных составляющих

иувеличении размеров пор).

Количественный состав трабекулярной и кортикальной костной ткани представлен в табл. 6.1 [22]. Костная ткань состоит из минералов, органических волокон и воды. Оставшаяся после сжигания

в губчатой и плотной ткани соответственно равны 39,1 % и 39,4 %.

185

где ξ мин, ρ мин – объемное содержание и плотность минерала; ξ о, ρ о – объемное содержание и плотность органических воло-

кон;

ξ в, ρ в – объемное содержание и плотность воды.

Плотности компонентов матрикса: ρ мин = 3,2 г/мл, ρ о =1,1 г/мл, ρ в =1 г/мл.

6.2. Гистологический метод определения структуры костной ткани

В настоящее время известны два метода количественного определения характеристик структуры костной ткани: гистологический и стереологический. Гистологический метод позволяет изучать тонкие элементы структуры с характерным размером не более 1 мкм, например клетку, тогда как стереологический метод имеет меньшее разрешение, не более 100 мкм. Однако стереологический метод, в отличие от гистологического, позволяет получить пространственные характеристики структуры. Ниже рассматривается гистологический метод, описание и применение стереологического метода приводится в гл. 7.

В основе гистологического исследования биологических тканей лежит исследование под микроскопом. Для его проведения требуется, чтобы эти ткани были очищены и заключены в твердую сплошную среду для сохранения формы и клеточной анатомии при последующем приготовлении опытных образцов (секций). В качестве такой сплошной среды традиционно выбирается парафин из-за своей низкой точки плавления и способности смешиваться с другими органическими смесями, используемыми для обезвоживания и фиксации ткани. В гистологической лаборатории небольшие кусочки ткани, обычно размером в кубический сантиметр, опускают в форму с расплавленным парафином и оставляют затвердевать. Вставленные «тканевые блоки» затем устанавливаются в микротом (специальное режущее устройство) и нарезаются на тонкие секции толщиной примерно 5 мкм, которые монтируются на стеклянные пластинки для микроскопического исследования в проходящем све-

186

те. Таким образом, секция, по существу, является тонкой пластинкой мягкого воска с взвешенным внутри него клеточным и внеклеточным материалом.

Гистологическое исследование костей представляет особую проблему из-за их твердости. Очевидно, что попытка обработать костную ткань обычным микротомом приведет к поломке его ножей. Чтобы обойти эту проблему, образец сначала деминерализуют (удаляют из него кальций, фосфор и другие минералы). Методы деминерализации костной ткани применяются начиная с середины

ХХвека, и для растворения и извлечения минерала обычно используют растворы кислоты или щелочных агентов. Поскольку основным минералом в костной ткани является кальций, деминерализацию костной ткани часто называют декальцификацией. После деминерализации образец костной ткани становится достаточно мягким для обработки стандартным методом вставки в парафин и разрезки на секции. Хотя такие методы делают возможным заключение костной ткани в парафин, они не дают полной микроскопической картины, особенно при рассмотрении кости как динамически изменяющейся структурной ткани. Для изучения кости как ткани обычно используют нетронутые минерализованные секции, для чего требуется специальное оборудование и специальные процедуры обработки.

До появления пластиков в 30-х годах ХХ века единственным способом приготовления из кости приемлемых минерализованных секций являлось шлифование не заключенных в парафин секций. Чаще всего секции (толщиной 100 мкм и больше) грубо нарезались вручную и обрабатывались влажной наждачной бумагой. Так, с помощью этого метода были осуществлены основополагающие исследования Фроста [20]. Для приготовления более тонких секций образцы иногда шлифовались между двумя стеклянными пластинками с помощью абразивного порошка. Таким способом можно получать прекрасные гистологические образцы толщиной всего 5 мкм, однако эта методика требует много времени, утомительна и приводит к риску разрушения трабекулярной архитектуры.

Выход из этой ситуации нашелся, когда в сороковых годах

ХХвека в качестве заключающей среды вместо парафина стали

187

использовать полимеры. Подобно заключению в парафин, образцы кости можно погрузить в их растворы, которые затем полимеризуются. Эти твердые пластики очень близки по материальным свойствам к кости, и тонкие секции (менее 10 мкм) можно нарезать прямо из тканевых блоков, используя специализированные мощные микротомы, а толстые секции (100 мкм) можно приготовить без шлифования с помощью алмазной пилы.

В конце XX века исследования гистологических секций кости без деминерализации (и часто без заключения в сплошную среду) объяснили клеточные механизмы, ответственные за нормальный рост и восстановление кости. Были определены гистологические проявления метаболических заболеваний кости. Фрост и его коллеги [20] разработали методики окрашивания и анализа для минерализованных секций кости, которые дают возможность ясно идентифицировать структуру костной ткани, а также картину ее минерализации. Эти методы помогают понять сложную деятельность клеток, ответственных за поддержание механической целостности скелета на протяжении всей жизни, особенно при использовании флюорохромных меток.

История таких меток началась в 1736 году, когда Джон Велчер обнаружил, что живую костную ткань у домашнего скота можно пометить, добавляя животным в пищу краску, полученную из марены. Однажды он заметил красные полосы в костях свинины, которую ел на обед, и оказалось, что эта свинья съела отходы из красильной мастерской. Используя это открытие, в конце XVIII века английский хирург и анатом Дж. Хантер, используя накормленных красителем свиней, впервые обнаружил, что при росте скелета кости растут радиально за счет эндостальной резорбции и периостальной аппозиции (в то время преобладало мнение, что кости расширяются наружу вследствие депозиции новой кости внутри кортекса). В XIX веке вместо натуральной краски для меток кости стал применяться синтетический препарат ализарин. Краски связываются минералом кости в процессе его формирования и поэтому окрашивают в основном промежутки между остеоидом и минерализованной костью.

188

Современное использование красящих меток в гистоморфометрии человеческой кости началось в 50-х годах ХХ века. Обнаружилось, что обычный антибиотик тетрациклин включается в активно минерализующиеся поверхности кости и флюоресцирует желтым цветом при наблюдении гистологических секций в ультрафиолетовом свете [31]. Впервые стало возможно безопасно изучать динамику моделирования и перестройки кости человека. Вскоре основанный на тетрациклине гистологический анализ перестройки кости стал широко использоваться для изучения физиологии кости. В настоящее время методы флюорохромных меток обычно применяются для изучения эффективности новых препаратов для предотвращения остеопороза и других метаболических болезней кости, эффективности новых методик лечения, направленных на более быстрое заживление переломов, и для исследования откликов кости на полную замену сустава и другие имплантаты.

Кроме ализарина и тетрациклина есть и другие препараты, используемые для меток in vivo. Это, например, кальцеин зеленый, кальцеин синий и ксиленол оранжевый. Оказалось, что все эти составы флюоресцируют, и все вместе они названы флюорохромами. Последовательное назначение различных флюорохромов, которые флюоресцируют разным цветом, позволяет исследователю прослеживать временной график развития скелетных процессов, таких как заживление перелома.

6.3. Определение плотности костной ткани in vitro

Плотность костной ткани является основной характеристикой ее состояния, поскольку она отражает как структурные изменения, так и изменения состава. Это видно после подстановки ξ м из равен-

ства (6.4) в (6.5).

где плотность явно зависит от пористости, а через соотношение (6.6) и от объемного содержания минералов. Поэтому определение плотности является важной проблемой физиологии и необходимым условием диагностики и лечения заболеваний костной ткани [15].

189

Метод измерения in vitro (на образцах костной ткани) дает возможность непосредственного измерения плотности, поэтому его результаты используются как ориентировочные средние значения, чтобы оценить адекватность методов измерения плотности костной ткани пациентов.

Физическая, или наблюдаемая, плотность определяется на образцах костной ткани, полученных аутопсией (вырезанием) из фрагмента кости трупа. Вырезание образца осуществляется микротомом или хирургической пилой при небольших скоростях резания с целью сохранения структуры и предотвращения разогрева образца, уменьшающего его влажность и способствующего бактериальному разложению. Чтобы предотвратить высыхание и разложение препарата до исследования, материал хранится в герметичной таре при температуре –2 …− 4°С не более одних суток после получения материала. Перед проведением испытаний материал выдерживается в помещении в этой же таре в течение 3 часов с целью равномерного согревания до 20 °С.

Точность эксперимента определяется в основном точностью измерения объема образца, поскольку для определения массы используются электронные весы с ценой деления не более 0,001 мг. Поэтому важно придать образцу при остеотомии форму прямоугольного параллелепипеда, что вызывает трудности механической обработки, обуславливающие разброс результатов эксперимента. Так, средние по возрасту, полу и локализации значения плотности влажной губчатой костной ткани лежат в интервале 1,85 г/см3 [26]−1,87 г/см3 [21]. Для плотной костной ткани среднее значение плотности равно 1,91 г/см3 [21].

Плотность влажной губчатой костной ткани неоднородна в объеме кости. Так, средние значения физической плотности влажной губчатой костной ткани в головке, шейке и вертельной области проксимального отдела бедра для лиц обоих полов в возрасте 40–80 лет соответственно равны 1,94, 1,45 и 1,82 г/см3 [1]. Осреднение проводилось по четырем образцам в каждой локализации. Различие этих величин объясняется неоднородностью структуры и минерального содержания.

190