A_D_Ado_-_Patologicheskaya_fiziologia_2000_g

ном слое ведет к угнетению, а затем к инверсии работы 3Na+/Ca2+ ионообменного механизма, следовательно, уменьшается отток Са2+ из клетки в обмен на входящие Na+. Также происходит снижение электрического потенциала мембраны митохондрий, что влечет за собой уменьшение, а затем и потерю способности митохондрий аккумулировать внутриклеточный кальций.

Повышение концентрации ионов кальция в клетке вызывает активацию протеаз и фосфолипаз, что приводит к гидролизу фосфолипидов мембраны, нарушению их структуры и функции. В результате становятся более выраженными нарушения кальциевого обмена, ускоряются процессы накопления кальция в клетке. Образование такого порочного круга в итоге вызывает серьезные функциональные нарушения, а затем и гибель клетки. В дополнение к этому накопление Na+ и Са2+ в клетке увеличивает осмолярность цитоплазмы, что влечет за собой приток воды в клетку и формирование гипоксического отека тканей.

При гипоксии в различных тканях выявлено увеличение продукции оксида азота. Умеренная активация эндотелиальной и нейрональной N0синтазы, видимо, имеет адаптивное значение: умеренная активация продукции N0 сопровождается расширением прекапиллярных сосудов, снижением адгезии и агрегацией тромбоцитов, активацией синтеза стресс-белков, защищающих клетку от повреждений. Однако гиперпродукция оксида азота оказывает повреждающее действие, особенно на нервные клетки. К тому же гипоксия нервной ткани увеличивает секрецию глутамата, который оказывает не только возбуждающее медиаторное, но и цитотоксическое действие, вызывая гибель нейронов.

Чувствительность различных тканей к недостатку кислорода неодинакова: в первую очередь при гипоксии страдает нервная система. Первоначальное эмоциональное и двигательное возбуждение (состояние эйфории) при длительной и глубокой гипоксии сменяется генерализованным торможением, адинамией; возникают грубые нарушения высшей нервной деятельности вплоть до потери сознания.

10.4.Коррекция гипоксии: необходим избыток или недостаток кислорода?

Поскольку гипоксия обусловлена уменьшением кислородоснабжения тканей, представлялась вполне естественной коррекция гипоксических состояний путем обогащения вдыхаемого воздуха кислородом. Действительно, гипербарическая оксигенация, дыхание газовыми смесями с увеличенным содержанием кислорода весьма эффективны при глубокой циркуляторной гипоксии, когда компенсаторно-приспособительные реакции практически полностью исчерпаны.

Однако нельзя забывать, что кислород является мощным окислителем, его избыток токсичен для организма. Поэтому в случаях умеренной гипоксии разного происхождения применяют периодическое дыхание газовыми смесями с содержанием 10-—12 % кислорода.

288

Глава 11. Механизмы опухолевого роста

Клеточное размножение — фундаментальный биологический процесс, обеспечивающий преемственность поколений, образование многоклеточных организмов на ранних стадиях их развития, гомеостаз уже сформированных органов и тканей. В последнем случае имеется в виду постоянное (хотя и в разной степени выраженное) обновление всех тканей, поддерживаемое балансом процессов клеточной гибели (апоптоз) и клеточного размножения (пролиферация).

В организме человека ежедневно гибнут и рождаются десятки миллиардов клеток. Координировать эти процессы в «интересах» организма призвана чрезвычайно сложная система регуляции, которая включает, в частности, множество гуморальных факторов, секретируемыхво внутреннюю среду организма специализированными органами (эндокринная регуляция) и отдельными клетками (паракринная регуляция). Эти факторы могут оказывать как стимулирующее, так и тормозящее воздействие на процесс клеточного деления. Его «мишенями», как правило, могут быть не все клетки, а лишь те, которые имеют на своей поверхности особые структуры — рецепторы, способные воспринимать этот стимул и передавать его во внутреннюю среду клетки. Этот так называемый митогенный сигнал индуцирует каскад биохимических реакций (в основном фосфорилирования) и как итог — вхождение клетки в цикл деления. Напротив, факторы, блокирующие клеточное размножение, индуцируют выход клетки из цикла.

Принципиально таким же способом реализуется и феномен клеточной гибели — одни клетки секретируют, а другие воспринимают факторы, побуждающие их к «самоубийству», которое осуществляется в результате множества строго координированных биохимических реакций. Трудно переоценить значение апоптоза — именно таким способом организм избавляется от стареющих и функционально дефектных клеток, несущих потенциальную угрозу ракового перерождения.

Нарушение этой сложной системы регуляции на любом ее этапе может привести к опухолевой трансформации, т.е. к нерегулируемому (не подчиняющемуся сигналам) клеточному размножению. Таким образом, установлено, что, во-первых, существует много причин ракового перерождения клетки, и, во-вторых, рост опухоли может быть обусловлен как усилением клеточного размножения, так и ослаблением клеточной гибели. По достижении числа клеток, превышающего некий критический уровень, возникает опухоль, развивающаяся по своим особым законам и становящаяся более автономной и злокачественной.

290

Детальное выяснение механизма клеточного деления, с одной стороны, и опухолевой трансформации клетки — с другой, стало возможным только в последней четверти XX в. Основными предпосылками для этого были расшифровка структуры, функции и регуляции гена, развитие генной и клеточной инженерии, компьютеризация научного поиска. Очень важно и то обстоятельство, что фундаментальные биологические процессы чрезвычайно консервативны и сохраняют свои основные черты у эволюционно далеких видов. Это позволяет использовать в исследованиях наряду с традиционными экспериментальными животными более простые

идоступные анализу организмы (дрозофила, дрожжи, нематоды и т.п.).

11.1.Механизмы клеточного деления

Эндокринная, паракринная и аутокринная регуляция. В норме клетки делятся исключительно под воздействием различных факторов внутренней среды организма (и внешних — по отношению к клетке). В этом состоит их коренное отличие от трансформированных клеток, делящихся под воздействием эндогенных стимулов. Существуют два типа физиологической регуляции — эндокринная и паракринная. Эндокринная регуляция осуществляется специализированными органами (железами внутренней секреции), в числе которых гипофиз, надпочечники, щитовидная, паращитовидная, поджелудочная и половые железы. Они секретируют продукты своей активности в кровь и оказывают генерализованное воздействие на весь организм.

Паракринная регуляция характеризуется тем, что в одной и той же ткани соседние клетки воздействуют друг на друга посредством секретируемых и распространяющихся диффузией активных веществ. К числу таких митогенных стимуляторов (полипептидные ростовые факторы) относятся эпидермальный фактор роста, фактор роста тромбоцитов, ин- терлейкин-2 (фактор роста Т-клеток), фактор роста нервов и множество других.

Аутокринная регуляция, характерная для опухолевых клеток, отличается от паракринной тем, что одна и та же клетка является и источником ростового фактора, и его мишенью. Результат — непрекращающееся, самоподдерживающееся митогенное «возбуждение» клетки, приводящее к нерегулируемому размножению. При этом клетка не нуждается во внешних митогенных стимулах и становится полностью автономной.

Перенос митогенного сигнала — процесс многоэтапный. В зависимости от типа клетки и от конкретного митогенного стимула реализуется один из множества сигнальных путей. Ниже в качестве «прототипа» описан так называемый МАР-киназный каскад.

Ростовые факторы (регуляторы пролиферации) секретируются одними клетками и действуют паракринным образом на другие. Это небольшие белки. Полипептидная цепь EGF (epidermal growth factor) состоит, например, из 53 аминокислот. Существует несколько семейств ростовых

291

факторов, представитель каждого из которых объединен структурным и функциональным сходством. Одни из них стимулируют пролиферацию (например, EGF и PDGF, platelet-derived growth factor, тромбоцитарный фактор роста), а другие (TGF-(3, TNF, интерфероны) — подавляют.

Рецепторы расположены на клеточной поверхности. Каждая клетка имеет присущий ей репертуар рецепторов и соответственно свой особый набор ответных реакций. Очень важное в функциональном отношении семейство образуют так называемые тирозинкиназные рецепторы (ТКР), обладающие ферментативной (протеинкиназной) активностью. Они состоят из нескольких доменов (структурно-функциональных блоков): внеклеточного (взаимодействующего с лигандом — в данном случае с ростовым фактором), трансмембранного и подмембранного, обладающего тирозинпротеинкиназной активностью. В зависимости от структуры ТКР подразделяют на несколько субклассов.

При связывании с ростовыми факторами (например, EGF) молекулы рецепторов димеризуются, их внутриклеточные домены сближаются и индуцируют межмолекулярное автофосфорилирование по тирозину. Этоттрансмембранный перенос сигнала —• начало волны «возбуждения», распространяющейся затем в виде каскада реакций фосфорилирования внутрь клетки и достигающей в итоге хромосомного аппарата ядра. ТКР обладают тирозинкиназной активностью, но по мере продвижения сигнала внутрь клетки тип фосфорилирования меняется на серин/треониновый.

Ras-белки. Одним из наиболее важных является сигнальный путь с участием Ras белков (это подсемейство так называемых G-белков, образующих комплексы с гуаниловыми нуклеотидами; Ras-GTP — активная форма, Ras-GDP — неактивная). Этот путь — один из основных в регуляции клеточного деления у высших эукариот — настолько консервативен, что его компоненты способны заменить соответствующие гомологи в клетках дрозофилы, дрожжей и нематод. Он опосредует многочисленные сигналы, исходящие из окружающей среды, и функционирует, по-видимо- му, в каждой клетке организма. Ras играет роль своеобразного турникета, через который должен пройти почти любой из поступающих в клетку сигналов. Критическая роль этого белка в регуляции клеточного деления известна с середины 80-х годов, когда активированная форма соответствующего гена (онкоген Ras*) была обнаружена во многих опухолях человека. Активация онкогена (онкогены — гены, вызывающие нерегулируемое клеточное деление) — одно из главных событий канцерогенеза. Это такое повреждение нормального, участвующего в регуляции клеточного размножения гена (протоонкогена — нормального клеточного гена, способного при нарушении структуры индуцировать опухолевый рост), которое де-

* Названия онкогенов в ряде случаев (ноне всегда) происходят оттехретровирусов, в которых они были первоначально обнаружены, и, как правило, не отражают

их функционального назначения.

292

лает его перманентно работающим (активным) и, тем самым, индуцирующим столь же непрерывное (нерегулируемое) клеточное деление. Поскольку в регуляции клеточного размножения принимает участие множество клеточных генов (протоонкогенов), повреждение которых потенциально способно вызывать опухолевый рост, то соответственно существует и множество (несколько десятков, а возможно и сотен) онкогенов.

В конкретной ситуации Ras-опосредованного сигнального пути (например, при взаимодействии EGF с рецептором) димеризация последнего приводит к автофосфорилированию одного из остатков тирозина в его подмембранном домене. В результате этого становится возможной самосборка («рекрутирование» в комплекс) ряда белков, расположенных ниже в сигнальном пути (адаптерный белок Grb2, белок Sos1). Этот мультибелковый комплекс локализован в плазматической мембране.

МАР-киназный каскад. МАР-киназы (mitogen activated protein kinases) — серин/треониновые протеинкиназы, активируемые в результате митогенной стимуляции клетки. Киназный каскад возникает как следствие последовательной активации одного фермента другим, стоящим «выше» в сигнальном пути. Как следствие стимуляции белка Ras и формирования подмембранного комплекса повышается активность двух цитоплазматических серин/треониновых МАР-киназ (известных так же как ERK1 и ERK2, extracellular signal-regulated protein kinases 1 and 2), которые перемещаются из цитоплазмы в ядро клетки, где фосфорилируют ключевые факторы транскрипции — белки-регуляторы активности различных генов.

Активация транскрипции. Группа генов, определяющих вхождение клетки в фазу S, активируется транскрипционным фактором АР-1 — комплексом белков Jun и Fos (гены, их кодирующие — c-Jun и c-Fos, относятся к числу протоонкогенов; с — от cell, обозначает их клеточное происхождение в отличие от вирусных онкогенов v-Jun и v-Fos). Эти транскрипционные факторы могут взаимодействовать между собой с образованием множества гомо- и гетеродимеров, связывающихся с определенными участками ДНК и стимулирующих синтез РНК на прилежащих к этим участкам генах. МАР-киназы повышают активность АР-1 двояким образом:

•опосредованным, активируя гены, кодирующие эти транскрипционные факторы, и увеличивая тем самым их содержание в клетке;

•прямым, фосфорилируя входящие в их состав сериновые и треониновые остатки.

Врезультате активации генов продуцируются белки, необходимые для синтеза ДНК и последующего митоза. Некоторые из новообразованных белков (Fos, Jun, Мус), известные как белки раннего ответа (immediateearly proteins), выполняют регуляторные функции; связываясь со специфическими участками ДНК, они активируют прилежащие гены. Другую группу составляют такие ферменты, как тимидинкиназа, рибонуклео-

293

тидредуктаза, дигидрофолатредуктаза, тимидилат-синтаза, орнитиндекарбоксилаза, ДНК-полимеразы, топоизомеразы и ферменты, которые имеют непосредственное отношение к синтезу ДНК. Кроме того, усиливается общий белковый синтез, поскольку при каждом цикле удвоения воспроизводятся все клеточные структуры.

Реализация митогенного сигнала. Результатом переноса митогенного сигнала является реализация сложной программы клеточного деления.

Клеточный цикл. Клетки могут находиться в одном из трех состояний — в цикле деления, в стадии покоя с сохранением возможности возврата в цикл и, наконец, в стадии терминальной дифференцировки, при которой способность к делению полностью утрачена. Образовывать опухоли могут только те клетки, которые сохранили способность к делению.

Цикл удвоения разных клеток человека варьирует от 18 ч (клетки костного мозга) до 450 ч (клетки крипт толстой кишки), в среднем — 24 ч. Митоз (М) и синтез ДНК (фаза S), между которыми выделяют 2 промежуточных (gap) периода — G1 и G2, наиболее заметны; во время интерфазы (период между двумя делениями) клетка растет и готовится к митозу. В период фазы G1 существует момент (так называемая точка рестрикции R), когда осуществляется выбор между вхождением в следующий цикл деления или переходом в стадию покоя G0. Вхождение клетки в цикл деления — процесс вероятностный, определяемый сочетанием ряда условий (внутренних и внешних); однако после того, как выбор сделан, последующие этапы совершаются автоматически. Хотя клетка может блокироваться на той или иной стадии цикла деления, обычно это может быть следствием каких-то особых обстоятельств.

Особенно важными в цикле являются моменты вхождения клетки в фазу синтеза ДНК (граница фаз G/S) и митоз (граница фаз G2/M), где действуют своеобразные «контрольно-пропускные пункты» (checkpoints), которые проверяют в первом случае целость ДНК (ее готовность к репликации), а во втором — завершенность репликации. Клетки с поврежденной или недорепл ицированной ДНК блокируются на границе соответствующих фаз, что предотвращает возможность передачи потомству дефектов ее структуры в виде мутаций, делеций и иных нарушений. Некая система надзора, по-видимому, существующая в клетке, индуцирует систему репарации ДНК, после завершения которой продвижение клетки по циклу может быть продолжено. Альтернативой репарации является апоптоз, радикальным образом устраняющий опасность возникновения в организме клона дефектных (потенциально опухолевых) клеток. Конкретный выбор зависит от множества условий, в том числе от индивидуальных особенностей клетки.

Процесс репликации ДНК сложен и длителен (занимает несколько часов), поскольку весь генетический материал клетки должен быть воспроизведен абсолютно точно. При возникновении в нем каких-либо отклонений клетка блокируется на подходе к митозу (на границе фаз G2/M)

294

и также может подвергнуться апоптозу. Защитное значение checkpoints трудно переоценить, поскольку их функциональные дефекты в конечном итоге имеют следствием и опухолевую трансформацию клетки и прогрессию уже сформировавшейся опухоли.

Циклические реакции. Существуют два семейства белков, «движущих» клеточный циклциклин(сусНп)-зависимые серин/треониновые протеинкиназы (Cdk, cyclin-dependent kinases) и сами циклины. Циклины регулируют активность Cdk и тем самым их способность модифицировать структуры-мишени, непосредственно участвующие в метаморфозах цикла. С их участием осуществляются такие важные этапы цикла, как дезинтеграция ядерной мембраны, конденсация хроматина, формирование веретена и ряд других. Cdk активны только в комплексе с одним из циклинов. В связи с этим сборка и активация многочисленных комплексов Cdkcyclin, а также их диссоциация — ключевые моменты клеточного цикла.

Как следует из их названия, циклины синтезируются и распадаются в строго определенные моменты цикла, различные для разных циклинов. Имеется три основных их класса: й^циклины, необходимые для прохождения GyS, S-циклины — для прохождения S-фазы и G2 (или митотические) — циклины для вхождения в митоз. В клетках млекопитающих имеется также несколько семейств Cdk, участвующих в разных регуляторных влияниях. Удаление того или иного циклина из внутриклеточной среды строго в определенный момент столь же важно, как и его появление (устранение циклинов из внутриклеточной среды достигается как их деградацией, так и блоком синтеза), например в митозе (на границе мета- и анафазы) в результате протеолиза один из циклинов быстро деградирует; если же этого не происходит, то митоз не может завершиться и разделения дочерних клеток не происходит.

Продвижение в фазе S требует активации киназ Cdk2, Cdk4 и Cdk6, которые взаимодействуют с в^фазными циклинами (в частности, с cyclin D). Комплекс Cdc2 с первым й^фазным циклином индуцируеттранскрипцию гена следующего циклина и т.д., продвигая клетки все дальше по циклу. Cdc2-cyclin D в самом начале замещается на Cdc2-cyclin Е, а тот в свою очередь — на Cdc2-cyclin А, активирующий аппарат синтеза ДНК. Когда клетка входит в S-фазу, й^циклины деградируют и появляются вновь лишь в фазе G1 следующего цикла.

Контрольно-пропускные пункты (checkpoints — англ.). Любое стрессорное воздействие (например, отсутствие питательных веществ, гипоксия, особенно повреждение ДНК) блокирует движение'по циклу в одном из двух упомянутых выше контрольных пунктов (checkpoints). Во время этих остановок активируются механизмы надзора, способные:

•обнаружить повреждение ДНК;

•передать сигнал неблагополучия, блокирующий синтез ДНК или митоз;

•активировать механизмы репарации ДНК.

295

Благодаря этому обеспечивается стабильность генома. Как упоминалось выше, механизм контроля G / S блокирует репликацию ДНК и активирует процессы репарации (или индуцирует апоптоз), тогда как механизм контроля G2 /M запрещает митоз до завершения репликации Дефекты этих механизмов могут привести к появлению дочерних клеток

споврежденным геномом.

Вмеханизме checkpoint участвуют комплексы Cdk-cyclin и ряд дополнительных белков — Rb, р53 и другие. Их совокупность образует систему «тормозов», не позволяющих клетке делиться в отсутствие адекватных стимулов. Гены, кодирующие эти белки, называют генами-супрессора- ми. Особая значимость этой системы заключается в том, что раковая

трансформация клетки становится возможной лишь после ее инактива-

ции. В соматической клетке существуют по два аллеля каждого из генов, втом числе и генов-супрессоров, и, следовательно, для их инактивации необходимы два независимых события (например, делеция одного аллеля и мутация другого). Именно по этой причине «спорадические» опухоли появляются относительно редко (вероятность возникновения в одной клетке нескольких независимых мутаций, причем поражающих один и тот же локус обеих хромосом, относительно невелика), а «семейные» чрезвычайно часты (в «раковых» семействах один из двух наследуемых аллелей того или иного гена-супрессора исходно дефектен). В последнем случае система «тормозов» у всех клеток данного организма обеспечивается лишь одним нормальным аллелем, что резко снижает ее надежность и повышает риск возникновения опухоли. Именно это и происходит при наследственной ретинобластоме (делеция одного аллеля Rb) и других наследственных синдромах (делеция или повреждение одного аллеля р53 или других генов-супрессоров).

У клеток с дефектным или отсутствующим белком-супрессором р53 контрольный пункт GyS неполноценен. Это проявляется в том, что повреждения ДНК, индуцированные ионизирующей радиацией или каким-либо другим способом, не приводят ни к задержке клеток на границе фаз G 1 /S, ни к апоптозу. В результате в популяции накапливаются клетки с множественными нарушениями структуры ДНК; появляется и со временем нарастает нестабильность генома, которая способствует возникновению новых клеточных клонов. Их естественный отбор лежит в основе опухолевой прогрессии — постоянного «дрейфа» опухоли ко все большей автономности и злокачественности.

Апоптоз (или программируемая клеточная гибель) — широко распространенный биологический феномен клеточного «самоубийства», которое индуцируется либо разнообразными внешними стимулами, либо неразрешимыми «внутренними» конфликтами (например, невозможностью репарации повреждений ДНК). Роль апоптоза велика не только в формообразовательных процессах во время эмбриогенеза (формирование органов, замена одних тканей другими, резорбция временных органов и т.д.), но и в поддержании тканевого гомеостаза во взрослом организме.

296

В регуляции тканевого гомеостаза гибель клетки выполняет функцию, комплементарную митозу. У опухолевых клеток программа гибели клеток в большинстве случаев блокирована, что вносит существенный вклад в увеличение массы опухоли.

Механизмы апоптоза. Принципиальное значение имеет тот факт, что механизмы апоптоза чрезвычайно консервативны и сохраняют свои основные закономерности у весьма далеких в эволюционном отношении организмов. Это обстоятельство позволило идентифицировать у млекопитающих (в частности у человека) гены, гомологичные генам апоптоза у нематоды, — организма, у которого впервые была обнаружена и изучена генетическая система, управляющая этим процессом.

В результате у млекопитающих были идентифицированы гены семейства Вс1-2. Роль самого Вс1-2 и некоторых его гомологов — антиапоптическая (предотвращение гибели клеток), тогда как у других членов семейства, например Вах, — проапоптическая. Белки Вах и Вс1-2 способны к комплексообразованию друг с другом. В зависимости от относительного внутриклеточного содержания про- и антиапоптических белков решается судьба данной клетки. Механизм действия белков семейства Вс1-2 не до конца ясен.

Большое функциональное значение имеет механизм апоптоза, индуцируемого через специфические рецепторы CD95 (трансмембранный белок-рецептор размером 45 кДа, который при связывании со специфическим лигандом или антителами передает сигнал к апоптозу) и TNF-R (tumor necrosis factor receptor, рецептор фактора некроза опухолей). Эти рецепторы, объединяемые сходством внеклеточных доменов, входят в состав большого семейства. Лигандами (молекулами, специфически взаимодействующими с рецепторами TNF-R и CD95) являются соответственно TNF и CD95-L, которые представляют собой трансмембранные белки, но могут функционировать и в растворимой, «свободной» форме. Особенно интересен, с онкологической точки зрения, TNF — цитокин, производимый многими клетками (макрофагами, моноцитами, лимфоидными клетками, фибробластами) в ответ на воспаление, инфекцию и другие стрессорные воздействия. Он индуцирует широкий спектр иногда противоположных по направленности реакций, включая лихорадку, шок, некроз опухоли, анорексию; а также иммунорегуляторные сдвиги, клеточное размножение, дифференцировку и апоптоз. В этом случае апоптоз осуществляется с участием специфической цистеиновой протеазы ICE, разрушающей многие внутриклеточные белки-мишени. Гиперэкспрессия ICE в клетке вызывает апоптоз.

11 »2. Патофизиология клеточного деления

«Базовые» (исполнительные) механизмы деления нормальной и опухолевой клетки одинаковы и осуществляются одними и теми же ферментными системами. Различия же заключаются в регуляции этого процесса, в частности в тех стимулах, которые его «запускают».

297