Выделение чистой культуры бактерий-аэробов занимает 3 дня:

1. День:

а) микроскопия мазка из материала (для ориентировочного суждения о составе микрофлоры);

б) посев материала на ПА в чашке истощающим штрихом (для получения изолированных колоний);

в) инкубирование в термостате (37⁰С) 18-20 часов

2. День:

а) изучение и выбор изолированных колоний;

б) микроскопия мазков из изолированных колоний для суждения об однотипности микробов в колонии;

в) пересев остатка колонии на скошенный ПА (для получения чистой культуры);

г) инкубирование в термостате (37°С). 18-20 часов

3. День:

а) микроскопия мазков из чистой культуры на скошенном ПА (для контроля чистоты просматривают не менее 40 полей зрения должны быть однотипные по морфологии микроорганизмы);

б) изучение других свойств выделенной чистой культуры.

Выделение чистой культуры анаэробов занимает 4 дня и отличается тем, что исследова­ние ведут в анаэробных условиях на специальных средах и материал предварительно подращивают сутки в среде для накопления анаэробов. Методы культивирования анаэробов основаны на удале­нии кислорода из питательной среды и из атмосферы (используют механическое и физическое удаление или замещение, химическое или биологическое связывание О₂)

• перед посевом среды регенерируют (кипятят и быстро охлаждают);

• делают посевы в высокие столбики среды в пробирках;

• наслаивают поверх питательной среды вазелиновое масло;

• культивируют в анаэроостате, из которого откачан воздух и замещён инертным газом или бескислородной смесью (азот, водород, углекислый газ);

• культивируют в эксикаторе, на дно которого помещены химические поглотители кислорода (щелочной раствор пирогаллола и др.);

• культивируют в герметично закрытой чашке с плотной средой, на две половины которой отдельно засевают анаэробы и аэробы, которые в ходе размножения поглощают кислород (метод Фортнера).

Генетика бактерий

Микроорганизмы послужили удобной моделью для генетических исследований приведших к важнейшим открытиям 21 века в биологии: показано, что материальным носителем (основой) наследственности являются нуклеиновые кислоты - ДНК и РНК; установлено детальное строение хромосомы; расшифрованы механизмы генетического обмена и его регуляции, достижения генетики микроорганизмов послужили основой для становления и развития новой перспективной отрасли - биотехнологии. Она призвана использовать свойства микробов и клеточных культур, биологических процессов в производстве: биологически-активных веществ (антибиотиков, гормонов, белков, аминокислот), энергоносителей, полезных новых видов микробов, сортов растений, видов животных, эффективных вакцин, а также в борьбе с загрязнением окружающей среды и болезнями растений.

Микробы как объекты генетических исследований, обладают рядом преимуществ: бактерии содержат гаплоидный набор генов, поэтому изменения их генотипа с неизбежностью влекут за со­бой изменение фенотипа; для них характерно быстрое размножение и огромная численность по­томства (быстрая смена поколений); работа с микробами не требует больших затрат.

Организация генетического материала бактерий

Геном бактерий (совокупность всех генов) представлен хромосомой, плазмидами и транспозируемыми элементами. Хромосома и плазмиды являются репликонами - элементами, способными к ав­тономной репликации (самоудвоению).

Хромосома представляет собой замкнутую в кольцо двухспиральную нить ДНК, плотно уло­женную в цитоплазме и несущую 95-99% генетической информации (дыхание, питание и другие важнейшие функции) Последовательность нуклеотидов в хромосоме определяет чередование оперонов, функционирование которых происходит также, как у других организмов.

Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы, представляющие собой замкнутые в кольцо двухспиральные молекулы ДНК, обычно находящиеся в скрученном состоянии в цито­плазме или в интегрированном состоянии (в составе хромосомы). Они кодируют 1-5% генетиче­ской информации (основном, адаптационные свойства), могут утрачиваться клеткой без потери жизнеспособности, а также передаваться от клетки-донора в клетку-реципиент. Трансмиссивные плазмиды передаются путем самопереноса при конъюгации, нетрансмиссивные - пассивно, путем трансдукции с участием умеренного бактериофага или при мобилизации трансмиссивной плазмидой в ходе конъюгации. Плазмиды могут содержать гены множественной лекарственной устойчи­вости (К - фактор), вирулентности (плазмиды токсигенности, адгезивности и др.), дополнительных ферментов метаболизма (утилизация лактозы, цитрата и др.). Плазмиды наделяют клетку допол­нительной генетической информацией, которая дает ей селективные преимущества (например, способность сохраняться во внутренней среде макроорганизма, где на микроб действуют защитные реакции организма и антибиотики, принимаемые в ходе лечения).

Транспозируемые элементы - это отдельные фрагменты ДНК, способные к многократному перемещению от одного репликона к другому без изменения структуры. Они не способны к авто­номной репликации (удваиваются вместе с хромосомой и плазмидой), могут перемещаться (в со­ставе плазмиды) от клетки-донора в клетку-реципиент, вызывая изменение ее генотипа. Различают вставки - последовательности не кодирующие известных признаков, и транспозоны, кодирующие 1 или несколько признаков (любых). Перемещение, в зависимости от вида элемента, может происходить в разные или в определенный участок репликона, что также является важным механизмом изменчивости микробов.

Изменчивость микроорганизмов

Различают генотипическую (наследуемую) изменчивость и фенотипическую (ненаследуемую, модификационную). Наследуемая изменчивость осуществляется в виде мутаций и рекомби­наций.

Мутации - это перегруппировка генов, не связанная с внесением в клетку нового генетиче­ского материала, ненаправленное изменение генотипа. Спонтанные мутации возникают без види­мых причин, как ошибки репликации; индуцированные - под влиянием мутагенов (УФО, ионизи­рующей радиации, алкилирующих агентов, азотистой кислоты, аналогов оснований ДНК и др.). Мутации могут проявляться в виде удвоения, выпадения, замены нуклеотидов, вставки (в том чис­ле транспозируемого элемента) и др.

Рекомбинации - это изменения генотипа, связанные с внесением в клетку-реципиент гене­тического материала от клетки-донора. Различают 3 вида рекомбинаций: трансформацию, трансдукцию, конъюгацию.

Трансформацией называют процесс: поглощения клеткой-реципиентом

изолированной ДНК клетки-донора (или синтетической нуклеиновой кислоты).

Трансдукция - перенос генетической информации (ДНК) при проникновении в клетку уме­ренного бактериофага (вирусных частиц, паразитирующих на бактериальных клетках).

Конъюгация - перенос генетической информации посредством трансмиссивных плазмид при непосредственном контакте донора и реципиента.

Мутации и рекомендации обеспечивают высокий уровень генетического обмена в различных микробиоценозах, позволяют микробам быстро адаптироваться к меняющимся условиям среды, эволюционировать, нередко приобретая нежелательные свойства - лекарственную устойчивость, повышенный патогенный потенциал. Все формы наследуемой изменчивости активно используют­ся в генно-инженерных исследованиях и биотехнологии.