МОЛБИОЛ 2014-лекции / ООФ / Л06-Генетическая рекомбинация _1

При гомологичной рекомбинации кассета нокаутного вектора, содержащая pgk-neor, но не pgk-tk, включается в геном эмбриональной стволовой клетки, которая выживает после позитивной селекции с неомицином и негативной - с ганцикловиром. Клон мутантных эмбриональных стволовых клеток инъецируется в бластоцист, который имплантируется суррогатной матери и развивается в химерное потомство.

Реакция гомологичной рекомбинации лежит в основе ряда методов трансгенеза (получение химерных и нокаутных

животных)

В нацеливающий вектор включены:

•ПС, гомологичные областям хромосомы, фланкирующим участок, который надо заместить;

•селективные маркеры:

-ген устойчивости к G418 (neor);

-ген тимидинкиназы (TK) HSV (Herpes Simplex Virus).

Позитивная селекция: клетки умирают, если культивируются в присутствии G418 без экспрессии neor.

Негативная селекция: клетки, экспрессирующие ТК, умирают в присутствииu ганцикловира.

61