МОЛБИОЛ 2014-лекции / ООФ / Л06-Генетическая рекомбинация _1
.pdf
Модель Холлидея
•Общая модель мейотического кроссинговера предложена в 1964 г. британским молекулярным биологом Р. Холлидеем (Robin Holliday) для объяснения результатов, полученных им и другими учеными при изучении генетики грибов.
•Модель была формальной, без детализации молекулярных механизмов рекомбинационных реакций, она не рассматривала белки, их осуществляющие, поскольку в начале 60-х г большинство из них не было известно.
•Последующие экспериментальные результаты хорошо вписались в модель Холлидея, они дополнили и уточнили ее.
•По существу история молекулярной генетики
рекомбинации - это развитие модели |
|
Холлидея. |
11 |
Модель мейотического •
кроссинговера по Холлидею
•
•
•
а. Рекомбинация начинается с первичных одноцепочечных разрывов фосфодиэфирных связей ДНК (их вносит фермент эндонуклеаза). Разрывы происходят в двух цепях одинаковой полярности.
Холлидей считал, что первичные разрывы возникают в определенных сайтах ДНК, которые Холлидей назвал «рекомбинаторами». Эта идея получила экспериментальное подтверждение.
б. От точек первичных разрывов происходит обмен цепями между дуплексами, который приводит к образованию крестообразной структуры, получившей название "полухиазма Холлидея".
В полухиазме в обмен вовлечены только две цепи ДНК, что отличает ее от полной хиазмы - продукта завершенного мейотического 12
кроссинговера
Модель мейотического кроссинговера
•в. Происходит перемещение точки перекреста цепей в полухиазме вдоль рекомбинирующих дуплексов - "миграция ветвления".
•От точки перекреста исходные дуплексы расплетаются и высвобождающиеся цепи тут же ренатурируют с комплементарными цепями из гомологичных дуплексов, что приводит к образованию и последующему удлинению гетеродуплекса (B / b).
•Биологический смысл миграции ветвления - удлинение гетеродуплекса.
•В миграции ветвления участвуют специальные ферменты.
•Размеры гетеродуплекса при мейотическом кроссинговере от нескольких сот до одной тысячи п.о., при рекомбинации в
соматических клетках и клетках прокариот - еще протяженнее. 13
Модель мейотического |
• Для разделения гетеродуплекса на |
|
кроссинговера |
гомологи должна произойти |
|
|
изомеризация полухиазмы и еще |
|
|
два вторичных разрыва цепей. |
|
|
• в‘. Схема изомеризации полухиазмы |
|
|
(Х. Поттер и Д. Дресслер, 1976): |
|
|
Происходит поворот на 1800 пары |
|
|
дуплексных сегментов. Изменении |
|
|
структуры происходит за счет |
|
|
теплового движения молекул. |
|
|
• г. Возможны две пары разрывов. |
|
|
Парные разрывы цепей одинаковой |
|
|
полярности 1-1 или 2-2 приводят к 2 |
|
|
типам рекомбинантных хроматид: |
|
|
– |
д. хроматиды содержат внутренний |
|
|
гетеродуплекс B/b, а по |
|
|
конфигурации фланговых маркеров |
|
|
А и С не отличаются от исходных |
|
|
(некроссоверные хроматиды); |
|
– |
е. рекомбинантные хроматиды |
|
|
кроссоверные, они содержат |
|
|
гетеродуплекс, но обмениваются |
Структуры в и в' |
|
частями по обе стороны от него. |
идентичны |
• Экспериментально показано, что |
|
|
|
14 |
|
оба типа продуктов рекомбинации |
|
равновероятны.
Электронномикроскопическая фотография открытой формы полухиазмы Холлидея
•Рекомбинантная структура выделена из хромосомной ДНК вегетативных клеток диплоидных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, находящихся в фазе G1 клеточного цикла, после обработки рестриктазой EcoR1
•Поскольку рестриктаза производит двуцепочечные разрывы по определенным сайтам, то в случае гомологичной рекомбинации должна образовываться попарно равноплечая крестообразная структура. Ветвь 1 по длине равна ветви 4, а ветвь 2 - ветви 3.
точка перекреста помечена Х.
15
Модель Холлидея
•Модель Холлидея универсальна:
–для про- и эукариот;
–Для половых и для соматических клеток.
•Хорошо проверяется генетическими данными. Практически все ее этапы постепенно нашли экспериментальное подтверждение:
–первичные разрывы происходят в определенных сайтах ДНК;
–полухиазмы наблюдали под электронным микроскопом;
–обнаружены резолвазы (эндонуклеазы), разрешающие полухиазмы;
–выделены белки, осуществляющие миграцию ветвления.
•Модель симметрична:
–первичные разрывы возникают одновременно, и обмен цепями происходит синхронно;
–однако имеются генетические данные и об ассиметричных обменах. Один из не укладывающихся в модель Холлидея фактов - асимметричный обмен цепями
ДНК, у ряда грибов Ascomycetes. |
16 |
|
•Рекомбинация начинается с разрыва или с бреши в одной цепи.
•1. После образования одноцепочечного разрыва в ДНК одной хроматиды происходит репарационный синтез и вытеснение свободного конца разорванной цепи.
•2. Вытесняемый конец внедряется в структуру двойной спирали партнера, вытесняя участок одной из ее цепей, в результате чего образуется петля.
•3. Петля расщепляется нуклеазами, образовавшиеся концы сшиваются. Протяженный гетеродуплекс возникает лишь на одной из рекомбинирующих молекул (ассиметричный гетеродуплекс).
1
2
Модель рекомбинации Мезельсона-Рэддинга
(1975 и 1982 гг)
3
17
Модель Холлидея
18
Синаптонем(аль)ный комплекс
•Для всех рекомбинационных процессов общим является этап, на котором молекулы ДНК вступают в контакт в участке, где произойдет обмен полинуклеотидными цепями. Этот этап получил название "синапсис".
•Синапсис (конъюгация хромосом) - попарное временное сближение гомологичных хромосом, во время которого между ними может произойти обмен гомологичными участками.
•При рекомбинации в мейозе формируется синаптонемный комплекс, который удерживает гомологичные хромосомы рядом, скрепляя их по всей длине.
•Впервые синаптонемный комплекс увидели на ультратонких (толщиной 0.8 мкм) срезах семенников речного
рака и мыши с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Его обнаружили в 1956 г. независимо друг от друга два американских исследователя — М. Мозес и Д.В. Фоссет.
Ультратонкий продольный срез синаптонемного комплекса свиной аскариды Ascaris suum, состоящего из двух латеральных и центрального элементов. К латеральным элементам прилегает плотно конденсированный19
хроматин.
Синаптонемный комплекс
•Синаптонемный комплекс представляет собой две белковые оси гомологичных хромосом, соединяющихся с помощью «застежкимолнии».
•Он напоминает веревочную лестницу. Сестринские хроматиды каждого гомолога остаются тесно сближенными, а их ДНК образует многочисленные петли.
•Как только завершается синапсис по всей длине хромосом, клетки вступают в стадию пахитены, на которой они могут оставаться несколько суток.
•На этой стадии в продольной щели синаптонемального комплекса появляются крупные рекомбинационные узелки, которые участвуют в кроссинговере.
•Рекомбинационные узелки - крупные белковые комплексы (диаметр ~90 нм) – место расположения мультиферментных «рекомбинационных аппаратов», которые подтягивают друг к другу локальные участки ДНК материнской и
отцовской хроматид через область синаптонемного комплекса. Общее число узелков примерно равно общему числу хиазм, наблюдаемых в профазе .
•Такие обмены приводят к перекрестам между двумя несестринскими
20
хроматидами (в обменах участвует по одной хроматиде из двух спаренных хромосом).