МОЛБИОЛ 2014-лекции / ООФ / Л06-Генетическая рекомбинация _1

RecA-филамент E.coli

АТР

41

*В зависимости от структуры ДНК-субстратов белок RecA может проводить разные рекомбинационные реакции

D-петля может быть закрытой, если в дуплекс внедряется одноцепочечный хвост42(а),

или открытой, если она формируется на конце линейного дуплекса (б и в).

Синаптическая стадия кроссинговера

•Реакции происходят только внутри филаментов.

•Филаменты могут вступать в рекомбинацию только с "голой", не находящейся

вфиламенте ДНК. Поэтому два филамента не рекомбинируют друг с другом.

•Взаимодействие филамента с голой ДНК осуществляется за счет второго сайта связывания RecA.

•Связывание с ДНК во втором сайте слабое. Из-за этого между филаментом и голой ДНК возникают лишь кратковременные контакты. Они становятся прочными только после встречи гомологичных последовательностей.

•После нахождения области гомологии формируется гетеродуплекс. Начинается с образования структуры, в которой задействованы три цепи ДНК (D-петля от англ. displacement loop - петля вытеснения).

•Одноцепочечная ДНК внедряется в дуплекс и образует двойную спираль

(гетеродуплекс) с комплементарной ей цепью, одновременно вытесняя вторую цепь.

43

Формирование RecA-ДНК филамента и начало рекомбинации

44

Постсинапсис: расширение гетеродуплекса путем однонитевой миграции ветвления и обмен цепями при участии RecA-филамента

•В постсинапсисе гетеродуплекс удлиняется путем миграции ветвления, которую in vitro также может осуществлять белок RecA.

•Миграция ветвления под действием RecA-белка сопровождается гидролизом АТФ, но происходит медленно, со скоростью несколько п.н./с. Удлинение гетеродуплекса происходит в направлении 5′-> 3′ однонитевой ДНК.

•Если одноцепочечная ДНК была в составе двуцепочечной молекулы (как хвост или брешь), то формирование филамента распространяется на дуплекс, что также сопровождается гидролизом АТР.

•В этом случае удлинение гетеродуплекса происходит путем двунитевой миграции ветвления. Формируется 4-нитевая ДНК. Вращение RecA-филамента вокруг своей оси

Рекомбинация у E.coli in vivo

•Таким образом, в условиях in vitro белок RecA способен осуществлять поиск гомологии, формировать синаптическую структуру на основе гетеродуплекса и производить обмен цепями между гомологами. Эти реакции стимулируются добавлением белка SSB, который выпрямляет одноцепочечную ДНК.

•В условиях in vivo вместе с RecA задействованы другие белки. В клетке белок RecA не проводит миграцию ветвления.

•Миграцию ветвления и разрешение полухиазмы более эффективно, чем RecA, осуществляют специальные белки, из них наиболее изучены RuvА, RuvB и RuvC.

–RuvА – узнает полухиазму и «нацеливает» на нее RuvB.

–RuvB – АТР-зависимая ДНК-хеликаза, осуществляет миграцию ветвления (много эффективнее, чем RecА); «нацеливает» RuvC.

–RuvC – разрешает полухиазму (резолваза).

•Разнообразие белков, работающих вместе с RecA, отражает разнообразие путей рекомбинации. Еще в 1973 году А. Кларк описал у E. coli три разных пути гомологичной рекомбинации, но ни один из них не функционирует без RecA-белка.

46

Модель ассоциации RuvА и RuvB со структурой Холлидея (по данным электронной микроскопии)

•RuvA непосредственно узнает открытую форму структуры Холлидея и связывается с ней в виде тетрамера.

•Два гексамера RuvB узнают комплекс полухиазмы c тетрамером RuvА; ДНК протянута сквозь центральное отверстие RuvВ-гексамера;

•Кольцевые RuvB вращают внутри себя ДНК как как винт в гайке, используя энергию АТР, в противоположных направлениях (хеликазная активность). Гексамеры RuvB похожи на хеликазы.

•В результате протягивания ДНК через RuvА/ RuvB комплекс происходит удлинение гетеродуплекса (двунитевая миграция ветвления).

47

Завершение рекомбинации белком RuvC

RuvC специфически разрешает полухиазму, внося парные разрывы в нити ДНК (вероятно, связанные с RuvA и RuvB)

48

Гомологичные ферменты рекомбинации у различных организмов